Pesticida munus criticum agunt in inopia ciborum globali tractanda et morbis humanis a vectoribus latis pugnandis. Attamen, crescens problema resistentiae pesticidarum urgente necessitate inventionis novorum compositorum quae scopos sub-utilizatos petunt. Canales potentiales receptorum transeuntium insectorum (TRPV) — Nanzhong (Nan) et inactivi (Iav) — canales heterologos (Nan-Iav) formare et ad organa mechanosensia locari possunt quae geotropismum, auditum et proprioceptionem in insectis mediantur. Quaedam pesticida, ut aphidopyrrolidonum (AP), Nan-Iav per mechanismos ignotos petunt. AP efficax est contra insecta perforantia-sugentia (hemiptera), cibum impediens functione filamentorum perturbanda. AP solum ad Nan ligare potest, sed solum Nan-Iav cum agonistis, incluso nicotinamido endogeno (NAM), interagere potest, ita activitatem canalium exhibens. Quamvis potentia Nan-Iav ut scopo insecticidae sit, parum notum est de structura canalium eius, locis ligationis regulatoriis et regulatione Ca2+-dependenti, quae ulteriorem progressionem insecticidae impediunt. In hoc studio, microscopia cryoelectronica adhibita est ad structuram Nan-Iav in insectis Hemipteris in statu sine ligando calmodulino, necnon cum AP et NAM ad limitem dominii cytoplasmatici repetiti ankyrini (ARD) determinandam. Mirum in modum, invenimus ipsum proteinum Nan pentamerum formare posse, qui per interactiones ARD ab AP mediatas stabilizatur. Hoc studium interactiones moleculares inter insecticidia et agonistas et Nan-Iav revelat, momentum ARD in functione et compositione canalium illustrans, et mechanismum regulationis Ca2+ explorans.
In prospectu mutationis climatis globalis gravioris crescentis, deteriorans securitas alimentaria globalis unum e maximis saeculi XXI provocationibus est, cum consequentiis pro societate progredientibus.1,2Relatio de Statu Securitatis Cibi et Nutritionis in Mundo 2023 (SOFI) ab Organizatione Mundi Sanitarius edita aestimat circiter 2.33 miliarda hominum toto orbe terrarum inopia cibi moderata vel gravi, problema diuturnum, laborare.3,4Infeliciter, aestimantur circiter 20% ad 30% vel plus frugum quotannis propter pestes et pathogena amitti, et calefactio globalis resistentiam pestium et vulnerabilitatem frugum exacerbare exspectatur.4, 5, 6, 7, 8Progressus pesticidorum maximi momenti est non solum ad fruges a pestibus protegendas et propagationem pathogenorum a vectoribus latorum minuendam, sed etiam ad morbos humanos a vectoribus latos, ut febrem dengue, malariam, et morbum Chagas, qui pesticidis magis magisque resistunt, pugnandos.5, 9, 10, 11
Inter praecipua proposita insecticidorum neurotoxicorum, canalis heterotetramericus TRPV Nanchung (Nan)-Inactivus (Iav) classem propositorum insecticidorum repraesentat, qui solum ultimo decennio detecti sunt, inter quae insecticida commercialiter praesto sunt, ut imidaclopridum et pyraclostrobinum.XII, XIII, XIVInsecticida semisynthetica aphidopyrrolifenum (AP) est productum nuper elaboratum et commercializatum cuius pars principalis est insecticida activum Inscalis®, quod AP ligat ad gradum activitatis subnanomolaris.15AP toxicitatem acutam humilem pollinatoribus, insectis utilibus, aliisque organismis non destinatis exhibet, et cum secundum instructiones in pittacio adhibetur, pressionem resistentiae erga alia insecticida minuere potest.XVI, XVII, XVIIINan et Iav late per species insectorum distribuuntur, tantum in neuronibus receptoribus extensionis chordalibus antennarum et membrorum co-exprimuntur, et ad auditum, perceptionem gravitatis, et proprioceptionem necessariae sunt.XIII, XVI, XIX, XX, XXI, XXIIAP, imidaclopridum, et pyraclostrobinum complexum Nan-Iav per mechanismum singularem stimulant, transductionem signorum proprioceptivorum tandem inhibentes.XIII, XVI, XXIIIIn insectis pungentibus et sugentibus (hemipteris), ut aphidis et aleoidis, amissio proprioceptionis facultatem eorum esus impedit, tandem ad mortem ducens.13,24Curiose, PA magnam affinitatem erga complexum Nan-Iav et parvam erga Nan solum exhibet. Ligatio PA ad Nan-Iav cursum electricum inducit, sed ligatio ad Nan solum actionem canalis non stimulat. Iav ipsum ad PA omnino non ligatur.16Hoc suggerit Nan et Iav fortasse se coniungere ut diversos complexus canalium Nan-Iav forment (e.g., cum diversis rationibus stoichiometricis vel diversis dispositionibus intra eandem rationem stoichiometricam) vel AP fortasse se ad plura loca coniungere. Praeterea, agonista naturalis nicotinamidum (NAM) ad Drosophilae Nan-Iav affinitate micromolari coniungitur, effectus similes illis aphidarum (AP) in vitro exhibens.XVI, XXVet reproductionem et pastionem aphidum inhibentes, ad mortem eorum tandem ducens25, 26Haec data multas quaestiones excitant. Exempli gratia, incertum manet quomodo heterodimer Nan-Iav formetur, quae loca ligationis ad parvas moleculas modulandas adhibeantur, et quomodo hae parvae moleculae functionem canalis regulent proprioceptionem supprimendo. Praeterea, causae cur Nan ipsum inactivum sit et parvam affinitatem pro AP habeat, dum heterodimer Nan-Iav activum sit et AP cum maiori affinitate liget, incertae manent. Denique, parum notum est de regulatione functionis Nan-Iav a Ca2+ dependente et quomodo in processus signalationis neuronalis integratur.. 13,21
In hoc studio, microscopiam cryo-electronicam, electrophysiologiam, et artes ligationis radioligandorum coniunctis, compositionem Nan-Iav et mechanismum ligationis eius cum regulatoribus parvarum moleculorum elucidavimus. Praeterea, calmodulinum (CaM) constitutive cum Iav et Nan pentameris AP-stabilisatis deprehendimus. Haec eventa perspicientiam magni momenti in regulationem ionum calcii in canalibus, compositionem canalum, et factores affinitatem ligationis ligandorum determinantes praebent. Magis autem interest quod confirmavimus ARD munus centrale in his processibus agere. Studium nostrum canalum insectorum completorum cum pesticidis agriculturae pertinentibus ligatorum...XXVII, XXVIII, XXIXProspectus aperit ad evolutionem industriae pesticidarum, efficaciam et specificitatem pesticidarum augens, et applicationem compositorum ad TRPV destinatorum ad alias species permittens ad securitatem alimentariam globalem et propagationem morborum vectoribus transmissorum tractandam.
Invenimus etiam Nan-Iav a Ca2+ regi, et mechanismum regulationis a CaM constitutive coniuncta mediari. Magni momenti est quod haec regulatio Nav a Ca2+ dependens a CaM significanter differt a mechanismis regulationis aliorum canalum ionicorum (e.g., canalum Na+ voltagio-regulatorum et canalum TRPV5/6).52, 53, 54, 55, 56, 57In canali Nav1.2, dominium C-terminale CaM helice cum dominio C-terminali (CTD) coniungitur, et Ca2+ ligationem dominii sui N-terminalis cum parte distali CTD inducit.56In canali TRPV5/6, dominium C-terminale CaM cum CTH ligat, et Ca2+ extensionem sursum dominii sui N-terminalis in porum inducit, ita permeabilitatem cationis inhibens.53,54Proponimus exemplar functionis Nan-Iav-CaM a Ca2+ regulatae (Fig. 4h). In hoc exemplo, dominium N-terminale CaM constitutive cum dominio C-terminali (CTH) Iav ligatur. In statu quietis (concentratione [Ca2+] humili), dominium C-terminale CaM cum Nan interagitur, conformationem ARD stabiliens et sic aperturam canalis promovens. Ligatio agonistae/insecticidae ad canalem aperturam pororum inducit, quae ad influxum Ca2+ ducit. Ca2+ deinde cum CaM ligatur, dissociationem dominii C-terminalis ab ARD Nan causans. Quia obstructio ligationis CaM essentialiter effectum inhibitorium Ca2+ abolet, haec dissociatio mobilitatem ARD modulat, ita inhibitionem vel desensitizationem Ca2+-dependentem causans. Celeris recuperatio currentium canalis post elutionem ionis calcii (Fig. 4g) suggerit hunc mechanismum celeres responsiones ad signa neuronalia Ca2+ mediata facilitare. Praeterea, regio C-terminalis Iav, quae adhuc parum intellecta est, alia munera in designatione canalium et regulatione currentis agere relata est.21
Denique, studium nostrum structuram altae resolutionis complexus canalis TRP insecticidae-insecticidae magni momenti in agricultura exhibet—inventum nobis antea ignotum. Praesertim, structuram et functionem canalis insecticidae in cellulis humanis (HEK293S GnTi–) potius quam in cellulis insecticidarum descripsimus. Cum crescente resistentia insecticidis et continua pressione in securitatem alimentariam et pathogena, opus nostrum informationem magni momenti praebet quae evolutionem novorum insecticidorum ad commodum salutis humanae et securitatis alimentariae globalis facilitabit. Studia demonstraverunt insecticida, ut AP, efficacia esse contra quasdam pestes cum secundum instructiones in inscriptione adhibentur et toxicitatem acutam humilem habere pollinatoribus utilibus, demonstrantes eorum salutem ambientalem.13,16Praeterea, probationes quarundam derivatorum AP in culices demonstraverunt eos tandem facultatem volandi amittere. Intellegere quomodo haec composita modulatoria cum Nan-Iav iungantur modificationem compositorum existentium vel evolutionem novorum compositorum ad efficaciora et...accuratusExterminatio pestium. Studium nostrum demonstrat interfaciem Nan-Iav ARD non solum ad moderandam actionem compositorum endogenorum, pesticidorum, et Ca2+-CaM, sed etiam ad congregationem canalium necessariam esse. Suggerimus perturbationem congregationis heterodimerorum cum parvis moleculis fortasse esse modum singularem et promittentem ad inhibitores canalium ionicorum evolvendos.
Ex octo genis orthologis, gena plenae longitudinis scarabaei fusci (Halyomorpha halys) Nanchung et Inactive selecta sunt, stabilitatem excellentem in detergentibus ostendentes. Gena synthetica ad expressionem humanam codonibus optimizata et in vectorem pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) utens locis restrictionis XhoI et EcoRI clonata sunt. Hoc curavit ut cloni in quadro cum notis C-terminalibus GFP-FLAG-10xHis et mCherry-FLAG-10xHis essent, quae a proteasi HRC-3C (PPX) finduntur, permittentes mutationes independentes.expressioInitia ad Nanchung et Inactive in vectorem pBacMam inserendos adhibita erant hae:
Imagines microscopicae singularum particularum captae sunt microscopio electronico transmissionis (FEI) Titan Krios G2, camera K3 et filtro energiae Gatan BioQuantum instructo. Microscopium ad 300 keV operatum est, cum energia 20 eV, magnitudine pixel exempli 1.08 Å/pixel (magnificatione nominali 81,000x), et gradiente defocalizationis ab -0.8 ad -2.2 μm variante. Registratio video peracta est 40 imaginibus per secundum utens microscopio Latitude S (Gatan) cum dosi nominali 25 e–px−1 s−1, tempore expositionis 2.4 s, et dosi totali circiter 60 e–Å−2.
Correctio motus radio inducti et ponderatio dosis in pellicula peractae sunt utens MotionCor2 in RELION 4.061. Aestimatio parametri functionis translationis contrastus (CTF) in cryoSPARC peracta est utens methodo aestimationis CTF fundata in maculis62. Photomicrographa cum resolutione aptationis CTF ≥4 Å ab analysi subsequenti exclusa sunt. Typice, subset 500-1000 photomicrographorum ad selectionem punctorum in cryoSPARC adhibitum est, secutum a pluribus circuitibus classificationis 2D post filtrationem ad imaginem referentialem claram ad selectionem particularum fundatam in exemplari obtinendam. Particulae deinde extractae sunt utens capsis finientibus 64 pixellorum et concatenatione 4-partita. Plures circuitus classificationis 2D peracti sunt ad categorias particularum non desideratas removendas. Modellum 3D initiale reconstructum est utens reconstructione ab initio et refinatum utens refinamento non uniformi in cryoSPARC. Classificatio 3D peracta est in cryoSPARC vel RELION secundum heterogeneitatem ARD. Nulla heterogeneitas significativa dominiorum membranae observata est. Particulae refinatae sunt utens methodis C1 et C2; Particulae cum altiore resolutione C2 symmetricae respectu C2 habitae sunt et in RELION importatae sunt ad refinementum Bayesianum. Particulae deinde ad cryoSPARC translatae sunt ad refinementum finale non uniforme et locale. Resolutio finalis et numerus particularum in Tabula 1 monstrantur.
Cum pentamera Nan+AP tractaremus, varias methodos ad resolutionem partium membranae (praesertim regionis pororum) emendandam exploravimus, ut subtractionem signorum et personationem TMD. Attamen hae conatus irritae fuerunt propter perturbationem potentia extremam in regione pororum et heterogeneitatem generalem TMD. Resolutio finalis calculata est utens persona automatice generata a methodo processus non uniformis in cryoSPARC, imprimis regionem ARD spectans. Haec resolutio significanter altior quam ea partium membranae (praesertim regionis VSLD) consecuta est.
Initialia exempla *de novo* formarum apo *cimicum* Nanchung et *Inactive* primum generata sunt per Coot63, et exempla *cimicum* Nan et *Iav* per AlphaFold264 generata sunt ad regiones fiduciae humilis identificandas. Exemplar Calmodulini fundatum est in aptationibus corporis rigidi exemplorum Ca2+-ligantium et Ca2+-liberarum in accessionibus PDB 4JPZ56 et 1CFD65, respective. Exemplaria refinata sunt per refinationem sphaericam ad stereochemiam rectam et geometriam bonam curandam. Phosphatidylcholinum, phosphatidylethanolamina, et phosphatidylserinum deinde ut densitates lipidorum bene definitae refinata sunt, et liganda NAM et AP in densitatibus correspondentibus in iuncturis angustis posita sunt. Fasciculi coercitionum generati sunt ex serie SMILES isoformarum per eLBOW in PHENIX66. Denique exempla in spatio reali in PHENIX refinata sunt per inquisitionem localem in reticulo et minimisationem globalem cum coercitionibus structurae secundariae. Servator MolProbity ad refinandum exemplar et analysin structurae adhibitus est, et illustrationes per PyMOL et UCSF Chimera X factae sunt. 67,68,69 Analysis aperturae per servum HOLE peracta est,70 et mappatio conservationis sequentiae per servum Consurf peracta est.71
Analysis statistica peracta est utens Igor Pro 6.2, Excel Office 365, et GraphPad Prism 7.0. Omnia data quantitativa exhibentur ut media ± error standard (SEM). Examen t Studentis (bicaudatum, non par) adhibitum est ad comparandos duos greges. Analysis variantiae unidirectionalis (ANOVA) deinde examen post hoc Dunnett adhibita est ad comparandos plures greges. *P< 0.05, **P< 0.01, et ***PValores < 0.001 pro significatione statistica aestimati sunt, secundum distributionem datorum. Valores Kd et Ki, et intervalla fiduciae 95% asymmetrica eorum per GraphPad Prism 10 computata sunt.
Plura de methodologia studii, vide quaeso Summarium Relationis Portfolio Naturae, cui nexus in hoc articulo est.
Initium exemplar constructum est utens exemplaribus calmodulinis ex databasibus PDB 4JPZ et 1CFD. Coordinatae in Banco Datorum Proteinorum (PDB) sub numeris accessionis 9NVN (Nan-Iav-CaM sine ligando), 9NVO (Nan-Iav-CaM nicotinamido iunctum), 9NVP (Nan-Iav-CaM nicotinamido et EDTA iunctum), 9NVQ (Nan-Iav-CaM aphenidolpyrrollino et calcio iunctum), 9NVR (Nan-Iav-CaM aphenidolpyrrollino et EDTA iunctum), et 9NVS (Nan pentamer aphenidolpyrrollino iunctum) depositae sunt. Imagines microscopiae cryoelectronicae correspondentes in Database Microscopiae Electronicae (EMDB) sub his numeris accessionis depositae sunt: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM sine ligando), EMD-49845 (complexus Nan-Iav-CaM cum nicotinamido), EMD-49846 (complexus Nan-Iav-CaM cum nicotinamido et EDTA), EMD-49847 (complexus Nan-Iav-CaM cum aphidopyrrollino et calcio), EMD-49848 (complexus Nan-Iav-CaM cum aphidopyrrollino et EDTA), et EMD-49849 (complexus Nan pentameri cum aphidopyrrollino). Data cruda ad analysin functionalem in hoc articulo exhibentur.
Tempus publicationis: XXVIII Ianuarii MMXXVI