Medicamentum anthelminticum N,N-diethyl-m-toluamidum (DEET) relatum est AChE (acetylcholinesterasem) inhibere et potentiales proprietates carcinogenas propter vascularizationem excessivam habere. In hoc scripto, demonstramus DEET cellulas endotheliales, quae angiogenesin promovent, specifice stimulare, ita incrementum tumoris augens. DEET processus cellulares ad angiogenesin ducentes, inter quos proliferationem, migrationem et adhaesionem, activat. Hoc cum productione NO et expressione VEGF aucta in cellulis endothelialibus coniungitur. Silentium M3 vel usus inhibitorum pharmacologicorum M3 omnes hos effectus abolevit, suggerens angiogenesin a DEET inductam M3-sensibilem esse. Experimenta quae signalationem calcii in cellulis endothelialibus et HEK receptores M3 superexprimentibus involvunt, necnon studia ligationis et docking, indicant DEET modulatorem allostericum receptorum M3 agere. Praeterea, DEET AChE inhibet, ita biodisponibilitatem acetylcholini et ligationem eius ad receptores M3 augens, et effectus proangiogenicos per regulationem allostericam amplificans.
Cellulae endotheliales primariae ex aorta murium Helveticorum isolatae sunt. Methodus extractionis ex protocollo Kobayashi adaptata est. Cellulae endotheliales murinae in medio EBM-2 cum 5% FBS calore inactivato addito usque ad quartum transitum cultae sunt.
Effectus duarum concentrationum DEET in proliferationem HUVEC, U87MG, vel BF16F10 per CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) analysatus est. Breviter, 5.10³ cellulae per puteum in lamina 96 puteorum seminatae sunt, per noctem adhaerere permissae, et deinde DEET per 24 horas tractatae. Post remotionem medii crescentis, solutionem ligantem tincturae in singulos puteos microlaminae adde et cellulas ad 37°C per 30 minuta incuba. Gradus fluorescentiae determinati sunt per lectorem microlaminae multimodalem Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania) instructum filtris excitationis 485 nm et filtris emissionis 530 nm.
Cellulae HUVEC in laminis 96 puteorum densitate 10⁴ cellularum per puteum seminatae sunt. Cellulae DEET per 24 horas tractatae sunt. Viabilitas cellularum per experimentum colorimetricum MTT (Sigma-Aldrich, M5655) aestimata est. Densitates opticae in lectore microlaminarum multimodali (Mithras LB940) longitudine undae 570 nm obtentae sunt.
Effectus DEET per angiogenesis experimenta in vitro investigati sunt. Curatio cum 10⁻⁸ M vel 10⁻⁵ M DEET formationem longitudinis capillaris in HUVECs auxit (Fig. 1a, b, virgae albae). Comparata cum grege testigo, curatio cum concentrationibus DEET ab 10⁻⁴ M ad 10⁻⁵ M variantibus ostendit longitudinem capillaris planitiem ad 10⁻⁸ M DEET attigisse (Fig. Supplementaria S2). Nulla differentia significativa inventa est in effectu proangiogenico in vitro HUVECs DEET tractatarum in intervallo concentrationis 10⁻⁸ M et 10⁻⁵ M.
Ad effectum DEET in neovascularizationem determinandum, studia neovascularizationis *in vivo* perfecimus. Post dies quattuordecim, mures quibus cellulae endotheliales cum 10⁻⁸ M vel 10⁻⁵ M DEET praecultae erant iniectae, haemoglobini contentum auctum significantem ostenderunt (Fig. 1c, virgae albae).
Praeterea, neovascularizatio DEET-inducta in muribus xenograftis U87MG investigata est, quibus DEET quotidie (ip) iniectum est dosi quae concentrationes plasmaticas 10⁻⁵ M inducere scitur, quod in hominibus expositis normale est. in 23. Tumores detectabiles (i.e. tumores >100 mm³) observati sunt 14 diebus post iniectionem cellularum U87MG in mures. Die 28, incrementum tumoris significanter auctum est in muribus DEET-tractatis comparatis cum muribus control (Fig. 1d, quadrata). Insuper, tinctio CD31 tumorum demonstravit DEET aream capillarem significanter auxisse, sed non densitatem microvasorum. (Fig. 1e–g).
Ad munus receptorum muscarinicorum in proliferatione a DETA inducta determinandum, 10⁻⁸ M vel 10⁻⁵ M DETA in praesentia pFHHSiD (10⁻⁷ M, antagonista selectivus receptoris M3) adhibitum est. Curatio HUVEC. pFHHSiD proprietates proliferativas DETA omnibus concentrationibus omnino obstruxit (Tabula 1).
Sub his condicionibus, etiam examinavimus utrum DEET longitudinem capillarium in cellulis HUVEC augeret. Similiter, pFHHSiD longitudinem capillarium a DEET inductam significanter impedivit (Fig. 1a, b, virgae griseae). Praeterea, similia experimenta cum M3 siRNA peracta sunt. Quamquam siRNA moderans non efficax erat in promovenda formatione capillarium, silentium receptoris muscarinici M3 facultatem DEET ad longitudinem capillarium augendam abolevit (Fig. 1a, b, virgae nigrae).
Praeterea, et vascularizatio in vitro et neovascularizatio in vivo a DEET inducta, sive 10⁻⁸ M sive 10⁻⁵ M, a pFHHSiD omnino obstructa est (Fig. 1c, d, circuli). Haec eventa indicant DEET angiogenesin promovere per viam sensibilem ad antagonistas receptorum M3 selectivos vel siRNA M3.
AChE est scopus molecularis DEET. Medicamenta ut donepezil, quae ut inhibitores AChE funguntur, angiogenesin enzymorum endothelialis (EC) in vitro et in exemplaribus ischaemiae membri posterioris murinis incitare possunt14. Effectum duarum concentrationum DEET in activitatem enzymi AChE in HUVEC probavimus. Concentrationes humiles (10⁻⁸ M) et altae (10⁻⁵ M) DEET activitatem AChE endothelialis comparatae cum condicionibus comparativis imminuerunt (Fig. 2).
Ambae concentrationes DEET (10⁻⁸ M et 10⁻⁵ M) actionem acetylcholinesterasis in HUVEC minuerunt. BW284c51 (10⁻⁵ M) ut exemplar moderationis inhibitorum acetylcholinesterasis adhibitum est. Resultata exprimuntur ut percentage actionis AChE in HUVEC duabus concentrationibus DEET tractatis comparatis cum cellulis vehiculo tractatis. Valores exprimuntur ut media ± SEM sex experimentorum independentium. *p < 0.05 comparatum cum exemplari (test comparationis multiplex Kruskal-Wallis et Dunn).
Oxidum nitricum (NO) in processu angiogenico 33 implicatur, ergo productio NO in HUVEC stimulatis DEET investigata est. Productio NO endothelialis DEET tractata aucta est comparata cum cellulis control, sed significationem tantum ad dosem 10-8 M attigit (Fig. 3c). Ad mutationes moleculares productionem NO DEET inductam moderantes determinandas, expressio et activatio eNOS per Western blotting analysatae sunt. Quamquam curatio DEET expressionem eNOS non mutavit, phosphorylationem eNOS in loco activationis (Ser-1177) significanter auxit, dum locum inhibitionis (Thr-495) comparata cum cellulis non tractatis in phosphorylatione eNOS minuit (Fig. 3d). Praeterea, proportio eNOS phosphorylatae in loco activationis et loco inhibitionis calculata est postquam quantitatem eNOS phosphorylatae ad quantitatem totalem enzymi normalizatam est. Haec proportio significanter aucta est in HUVEC tractatis cum qualibet concentratione DEET comparata cum cellulis non tractatis (Fig. 3d).
Denique, expressio VEGF, unius e praecipuis factoribus proangiogenicis, per Western blotting analysata est. DEET expressionem VEGF significanter auxit, dum pFHHSiD hanc expressionem omnino impedivit.
Cum effectus DEET et obsidioni pharmacologicae et deminutioni receptorum M3 obnoxii sint, hypothesim probavimus DEET fortasse signala calcii augere. Mirum est quod DEET calcium cytoplasmicum in HUVEC (data non exhibita) et HEK/M3 (Fig. 4a, b) pro ambabus concentrationibus adhibitis augere non potuit.
Tempus publicationis: XXX Decembris MMXXIV