In hoc studio, effectus stimulantes curationis coniunctae...regulatores incrementi plantarum(2,4-D et kinetin) et nanoparticulis ferri oxidi (Fe₃O₄-NPs) in morphogenesi *in vitro* et productione metabolitorum secundariorum in *Hypericum perforatum* L. investigatae sunt. Curatio optima [2,4-D (0.5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] parametros incrementi plantae significanter emendavit: altitudo plantae 59.6%, longitudo radicis 114.0%, numerus gemmarum 180.0%, et pondus calli recentis 198.3% comparatis cum grege testigo aucta est. Haec curatio composita etiam efficientiam regenerationis (50.85%) auxit et contentum hypericini 66.6% auxit. Analysis GC-MS magnas quantitates hyperosidi, β-patholeni, et alcoholis cetylici ostendit, quae 93.36% areae apicis totius repraesentant, dum contenta phenolicorum et flavonoidum totalium usque ad 80.1% aucta sunt. Haec eventa indicant regulatores incrementi plantarum (PGRs) et nanoparticulas Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) effectum synergicum exercere stimulando organogenesin et accumulationem compositorum bioactivorum, quod strategiam promittentem ad meliorationem biotechnologicam plantarum medicinalium repraesentat.
Hypericum perforatum L., etiam Hypericum perforatum appellatum, est planta herbacea perennis familiae Hypericacearum, quae valorem oeconomicum habet.[1] Inter eius componentes bioactivos potentiales sunt tannini naturalia, xanthona, phloroglucinolum, naphthalenedianthronum (hyperinum et pseudohyperinum), flavonoida, acida phenolica, et olea essentialia.[2,3,4] Hypericum perforatum methodis traditis propagari potest; tamen, natura temporum methodorum traditarum, germinatio seminum humilis, et susceptibilitas ad morbos potentiam eius ad culturam magnae scalae et formationem continuam metabolitorum secundariorum limitant.[1,5,6]
Itaque cultura textuum *in vitro* methodus efficax habetur ad celerem propagationem plantarum, conservationem opum germatis, et auctum proventum compositorum medicinalium [7, 8]. Regulatores incrementi plantarum (PGRs) partes cruciales agunt in regulanda morphogenesi et necessarii sunt ad culturam *in vitro* calli et organismorum integrorum. Optimizatio concentrationum et combinationum eorum est crucialis ad felicem perficiendum horum processuum evolutionis [9]. Ergo, intellegere compositionem et concentrationem aptam regulatorum magni momenti est ad incrementum et capacitatem regenerativam Hyperici (H. perforati) emendandam [10].
Nanoparticulae oxidi ferri (Fe₃O₄) sunt classis nanoparticularum quae ad culturam textuum evolutae sunt vel evoluuntur. Fe₃O₄ proprietates magneticas significantes, bonam biocompatibilitatem, et facultatem incrementum plantarum promovendi et accentus ambientales minuendi habet, itaque attentionem considerabilem in consiliis culturae textuum attraxit. Applicationes potentiales harum nanoparticularum includunt optimizationem culturae in vitro ad divisionem cellularum promovendam, absorptionem nutrimentorum emendandam, et enzyma antioxidantia activanda [11].
Quamquam nanoparticulae bonos effectus promovendos in incrementum plantarum demonstraverunt, studia de applicatione coniuncta nanoparticularum Fe₃O₄ et regulatorum incrementi plantarum optimizatorum in *H. perforatum* rara manent. Ut hanc lacunam scientiae explerem, hoc studium effectus effectuum earum coniunctorum in morphogenesin in vitro et productionem metabolitorum secundariorum aestimavit, ut novas perspicientias ad emendandas proprietates plantarum medicinalium praebeat. Ergo, hoc studium duo proposita habet: (1) concentrationem regulatorum incrementi plantarum optimizare ut formationem calli, regenerationem surculorum, et radicationem in vitro efficaciter promoveant; et (2) effectus nanoparticularum Fe₃O₄ in parametros incrementi in vitro aestimare. Consilia futura includunt aestimationem rationis supervivendi plantarum regeneratarum per acclimatizationem (in vitro). Expectatur ut eventus huius studii efficaciam micropropagationis *H. perforatum* significanter augebunt, ita ad usum sustinendum et applicationes biotechnologicas huius plantae medicinalis magni momenti contribuentes.
In hoc studio, explantamenta foliorum ex plantis Hypericis scelerati (plantis matribus) annuis in agro cultis obtenta sunt. Haec explantamenta ad condiciones culturae in vitro optimizandas adhibita sunt. Ante culturam, folia sub aqua destillata fluente per aliquot minuta diligenter abluta sunt. Superficies explantamentorum deinde immersione in ethanolo 70% per 30 secunda, deinde immersione in solutione hypochloriti natrii (NaOCl) 1.5% cum paucis guttis Tween 20 per 10 minuta disinfecta sunt. Denique, explantamenta ter aqua destillata sterili abluta sunt antequam ad proximum medium culturae transferrentur.
Per quattuor hebdomades sequentes, parametri regenerationis surculorum mensurati sunt, inter quos rata regenerationis, numerus surculorum per explant, et longitudo surculorum. Cum surculi regenerati longitudinem saltem 2 cm attigerunt, in medium radicationis translati sunt, constantem ex medio MS dimidiae fortitudinis, 0.5 mg/L acidi indolebutyrici (IBA), et 0.3% gummi guar. Cultura radicationis per tres hebdomades continuata est, quo tempore rata radicationis, numerus radicum, et longitudo radicum mensurata sunt. Quaeque curatio ter repetita est, cum 10 explantibus per repetitionem cultis, circiter 30 explants per curationem producens.
Altitudo plantae centimetris (cm) regula mensurata est, a basi plantae ad apicem folii altissimi. Longitudo radicis millimetris (mm) mensurata est statim post plantulas diligenter remotas et medium crescens remotum. Numerus gemmarum per explantam directe in unaquaque planta numeratus est. Numerus macularum nigrarum in foliis, quae noduli appellantur, visualiter mensuratus est. Hi noduli nigri creduntur glandulae hypericinum, sive maculas oxidativas, continentes esse et ut index physiologicus responsionis plantae ad curationem adhibentur. Post remotionem totius medii crescentis, pondus recens plantularum statera electronica cum accuratione milligrammatum (mg) mensuratum est.
Methodus ad celeritatem formationis calli computandam haec est: post culturam explantorum in medio continente varia regulatoria accretionis (kinases, 2,4-D, et Fe3O4) per quattuor hebdomades, numerus explantorum capaces callum formandi numeratur. Formula ad celeritatem formationis calli computandam haec est:
Quaeque curatio ter repetita est, cum saltem decem explantibus in unaquaque repetitione examinatis.
Ratio regenerationis proportionem textus calli reflectit quae processum differentiationis gemmarum feliciter post stadium formationis calli perficit. Hic index facultatem textus calli transformandi in textum differentiatum et crescendi in nova organa plantarum demonstrat.
Coefficiens radicationis est proportio numeri ramorum radices agere capacem ad numerum ramorum totum. Hic index successum stadii radicationis reflectit, quod in micropropagatione et propagatione plantarum maximi momenti est, cum bona radicatio adiuvat plantulas melius supervivere in condicionibus crescentibus.
Composita hypericini cum methanolo 90% extracta sunt. Quinquaginta mg materiae plantae siccae ad 1 ml methanoli addita sunt et per 20 min ad 30 kHz in purgatore ultrasonico (exemplar A5120-3YJ) temperatura ambiente in tenebris sonicata sunt. Post sonicationem, exemplum centrifugatum est ad 6000 rpm per 15 min. Supernatans collectum est, et absorptio hypericini ad 592 nm mensurata est spectrophotometro Plus-3000 S secundum methodum a Conceiçao et al. [14] descriptam.
Pleraque curationes cum regulatoribus incrementi plantarum (PGRs) et nanoparticulis oxidi ferri (Fe₃O₄-NPs) formationem nodulorum nigrorum in foliis regeneratis surculorum non induxerunt. Nulli noduli observati sunt in ullis curationibus cum 0.5 vel 1 mg/L 2,4-D, 0.5 vel 1 mg/L kinetini, vel 1, 2, vel 4 mg/L nanoparticulis oxidi ferri. Paucae combinationes leve augmentum in evolutione nodulorum (sed non statistice significantem) ad altiores concentrationes kinetini et/vel nanoparticulis oxidi ferri demonstraverunt, ut combinatio 2,4-D (0.5–2 mg/L) cum kinetino (1–1.5 mg/L) et nanoparticulis oxidi ferri (2–4 mg/L). Haec eventa in Figura 2 monstrantur. Noduli nigri glandulas hypericino divites repraesentant, tam naturaliter existentes quam utiles. In hoc studio, noduli nigri praecipue cum fuscescentia textuum coniuncti sunt, indicantes ambitum favorabilem accumulationi hypericini. Curatio cum nanoparticulis 2,4-D, kinetino, et Fe₃O₄ incrementum calli promovit, fuscescentiam minuit, et contentum chlorophylli auxit, functionem metabolicam emendatam et potentialem reductionem damni oxidativi suggerens [37]. Hoc studium effectus kinetini in combinatione cum nanoparticulis 2,4-D et Fe₃O₄ in incrementum et evolutionem calli Hyperici aestimavit (Fig. 3a-g). Studia priora demonstraverunt nanoparticulis Fe₃O₄ actiones antifungales et antimicrobiales habere [38, 39] et, cum regulatoribus incrementi plantarum in combinatione adhibentur, mechanismos defensionis plantarum stimulare et indices tensionis cellularis reducere posse [18]. Quamquam biosynthesis metabolitorum secundariorum genetice regulatur, eorum actualis proventus valde a condicionibus ambientalibus pendet. Mutationes metabolicae et morphologicae gradus metabolitorum secundariorum afficere possunt per regulationem expressionis genorum plantarum specificorum et responsionem factoribus ambientalibus. Praeterea, inductores activationem novorum genorum incitare possunt, quae vicissim actionem enzymaticam stimulant, tandem multiplices vias biosyntheticas activantes et ad formationem metabolitorum secundariorum ducentes. Insuper, aliud studium demonstravit umbram minuendo expositionem solis augere, ita temperaturas diurnas in naturali habitaculo *Hyperici perforati* elevando, quod etiam ad auctum hypericini proventum confert. His datis innixum, hoc studium munus nanoparticularum ferri ut potentialium inductorum in cultura textuum investigavit. Resultata demonstraverunt has nanoparticulas genes in biosynthesi hesperidini implicatos per stimulationem enzymaticam activare posse, ad auctam accumulationem huius compositi ducens (Fig. 2). Ergo, comparatione cum plantis sub condicionibus naturalibus crescentibus, dici potest productionem talium compositorum in vivo etiam augeri posse cum moderata sollicitudo cum activatione genorum in biosynthesi metabolitorum secundariorum implicatorum coniungitur. Curationes compositae plerumque effectum positivum in ratem regenerationis habent, sed in quibusdam casibus, hic effectus debilitatur. Notandum est curationem cum 1 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L kinasa, et variis concentrationibus independenter et significanter augere regenerationis ratem per 50.85% comparatam cum grege testigo (Fig. 4c). Haec eventa suggerunt specificas nanohormonum combinationes synergistice agere posse ad promovendum incrementum plantarum et productionem metabolitorum, quod magni momenti est pro cultura textuum plantarum medicinalium. Palmer et Keller [50] demonstraverunt curationem 2,4-D independenter formationem calli in St. perforatum inducere posse, dum additio kinasae significanter formationem et regenerationem calli auxit. Hic effectus debitus erat meliorationi aequilibrii hormonalis et stimulationi divisionis cellularis. Bal et al. [51] invenerunt curationem Fe₃O₄-NP independenter functionem enzymorum antioxidantium augere posse, ita promovendo incrementum radicum in St. perforatum. Media culturae continentia nanoparticulas Fe₃O₄ in concentrationibus 0.5 mg/L, 1 mg/L, et 1.5 mg/L ratem regenerationis plantarum lini auxerunt [52]. Usus kinetini, 2,4-dichlorobenzothiazolinoni, et nanoparticulorum Fe₃O₄ significanter auxit rationes formationis calli et radicum, attamen effectus secundarii potentiales usus horum hormonum ad regenerationem in vitro considerandi sunt. Exempli gratia, usus diuturnus vel altae concentrationis 2,4-dichlorobenzothiazolinoni vel kinetini variationem clonalem somaticam, accentum oxidativum, morphologiam calli abnormalem, vel vitrificationem efficere potest. Ergo, alta ratio regenerationis non necessario stabilitatem geneticam praedicit. Omnes plantae regeneratae aestimandae sunt utens signis molecularibus (e.g., RAPD, ISSR, AFLP) vel analysi cytogenetica ad homogeneitatem et similitudinem earum cum plantis in vivo determinandam [53,54,55].
Hoc studium primum demonstravit usum coniunctum regulatorum incrementi plantarum (2,4-D et kinetin) cum nanoparticulis Fe₃O₄ morphogenesin et accumulationem metabolitorum bioactivorum clavium (inter quos hypericinum et hyperosidum) in *Hyperico perforato* augere posse. Regimen curationis optimizatum (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) non solum formationem calli, organogenesin, et proventum metabolitorum secundariorum maximizavit, sed etiam effectum lenem inducentem demonstravit, tolerantiam stressis et valorem medicinalem plantae potentialiter emendans. Combinatio nanotechnologiae et culturae textuum plantarum suggestum sustinibile et efficax praebet ad productionem in vitro magnae scalae compositorum medicinalium. Haec eventa viam sternunt applicationibus industrialibus et investigationibus futuris in mechanismos moleculares, optimizationem dosis et praecisionem geneticam, ita investigationem fundamentalem de plantis medicinalibus cum biotechnologia practica coniungentes.
Tempus publicationis: XII Decembris MMXXXV