Incrementum meristemi apicalis surculi (SAM) magni momenti est ad architecturam caulis. Hormona plantarumgibberellinae(GAs) partes clavis agunt in coordinando incremento plantarum, sed munus eorum in SAM adhuc parum intellectum manet. Hic, biosensorem ratiometricum signalationis GA elaboravimus, proteinum DELLA fabricando ut functionem eius regulatricem essentialem in responsione transcriptionali GA supprimeret, degradationem eius post recognitionem GA servans. Demonstramus hunc biosensorem degradationis fundatum accurate mutationes in gradibus GA et sensu cellulari per evolutionem notare. Hoc biosensore usi sumus ad activitatem signalationis GA in SAM mappandam. Demonstramus signa GA alta praesertim in cellulis inter primordiis organorum sitis, quae praecursores cellularum internodiorum sunt, praesens esse. Methodis functionis amplificandae et amissae utentes, ulterius demonstramus GA orientationem plani divisionis cellularis moderari, ordinationem cellularem internodiorum canonicam constituens, ita specificationem internodiorum in SAM promovens.
Meristema apicale surculi (SAM), in apice surculi situm, continet nichum cellularum primordialium quarum activitas organa lateralia et nodos caulis modulariter et iterative per totam vitam plantae generat. Quaeque harum unitatum repetitarum, seu nodorum plantarum, internodia et organa lateralia in nodis, et meristema axillaria in axillis foliorum comprehendit. Incrementum et ordinatio nodorum plantarum mutantur per evolutionem. In Arabidopsis, incrementum internodale supprimitur per stadium vegetativum, et meristema axillaria dormientia manent in axillis foliorum rosettae. Per transitionem ad stadium floralem, SAM fit meristema inflorescentiae, internodia elongata et gemmas axillares, ramos in axillis foliorum caulinarum, et postea flores sine foliis generans. Quamquam progressum significantem fecimus in intellegendis mechanismis qui initiationem foliorum, florum et ramorum gubernant, relative parum notum est de origine internodiorum.
Intellegentia distributionis spatiotemporalis GAs (agentes GA) adiuvabit ad melius intellegendas functiones horum hormonum in variis textibus et in variis stadiis evolutionis. Visualizatio degradationis fusionis RGA-GFP expressae sub actione promotoris sui informationem magni momenti praebet de regulatione graduum GA totalium in radicibus15,16. Attamen, expressio RGA variat inter textus17 et regulatur a GA18. Ita, expressio differentialis promotoris RGA potest efficere exemplar fluorescentiae observatum cum RGA-GFP et ideo haec methodus non est quantitativa. Recentius, GA19,20 cum fluoresceino (Fl) bioactivo notatum accumulationem GA in endocortice radicis et regulationem graduum cellularium eius per translationem GA revelavit. Nuper, sensor GA FRET nlsGPS1 demonstravit gradus GA correlare cum elongatione cellularum in radicibus, filamentis, et hypocotylis obscure crescentibus21. Attamen, ut vidimus, concentratio GA non est solus parameter qui activitatem signalationis GA moderatur, cum a processibus sensuum complexis pendeat. Hic, innixi nostra cognitione viarum signalationis DELLA et GA, evolutionem et characterisationem biosensoris ratiometrici degradationis fundati pro signalatione GA referimus. Ad hunc biosensorem quantitativum evolvendum, usi sumus RGA mutante GA-sensibili, qui cum proteino fluorescente fusus et ubique in textibus expressus est, necnon proteino fluorescente GA-insensibili. Demonstramus fusiones proteinorum RGA mutantium signalationem GA endogenam non impedire cum ubique expressa est, et hunc biosensorem posse quantificare actionem signalationis ex inputu GA et processu signi GA ab apparatu sensorio resultantem cum alta resolutione spatiotemporali. Hoc biosensore usi sumus ad distributionem spatiotemporalem actionis signalationis GA mappandam et quantificandum quomodo GA mores cellulares in epidermide SAM regulat. Demonstramus GA orientationem plani divisionis cellularum SAM inter primordia organorum sitarum moderari, ita ordinationem cellularem canonicam internodii definiens.
Denique, quaesivimus num qmRGA mutationes in gradibus GA endogenis per hypocotylos crescentes nuntiare posset. Ante demonstravimus nitratum incrementum stimulare per augendam synthesim GA et, vicissim, degradationem DELLA34. Proinde, observavimus longitudinem hypocotyli in plantulis pUBQ10::qmRGA sub abundanti copia nitrati (10 mM NO3−) cultis significanter longiorem esse quam in plantulis sub condicionibus nitrati-carentibus cultis (Figura Supplementaria 6a). Congruenter cum responsione incrementi, signa GA altiora erant in hypocotylis plantularum sub condicionibus 10 mM NO3− cultarum quam in plantulis in absentia nitrati cultis (Figura Supplementaria 6b, c). Ita, qmRGA etiam monitorationem mutationum in signalatione GA inductarum per mutationes endogenas in concentratione GA permittit.
Ut intellegeretur utrum activitas signalationis GA a qmRGA detecta a concentratione GA et perceptione GA pendeat, ut expectatum est secundum designum sensoris, expressionem trium receptorum GID1 in textibus vegetativis et reproductivis analyzavimus. In plantulis, linea nuntiatoria GID1-GUS ostendit GID1a et c in cotyledonibus valde expressos esse (Fig. 3a-c). Praeterea, omnes tres receptores in foliis, primordiis radicum lateralium, apicibus radicum (praeter pileum radicis GID1b), et systemate vasculari expressi sunt (Fig. 3a-c). In SAM inflorescentiae, signa GUS tantum pro GID1b et 1c deprehendimus (Fig. Supplementaria 7a-c). Hybridatio in situ haec exemplaria expressionis confirmavit et ulterius demonstravit GID1c uniformiter expressum esse in gradibus humilibus in SAM, dum GID1b expressionem maiorem in peripheria SAM ostendit (Fig. Supplementaria 7d-l). Fusio translationalis pGID1b::2xmTQ2-GID1b etiam gradum expressionis GID1b ostendit, ab expressione humili vel nulla in centro SAM ad expressionem magnam in finibus organorum (Figura Suppletoria 7m). Ita, receptores GID1 non uniformiter distribuuntur per et intra textus. In experimentis subsequentibus, etiam observavimus overexpressionem GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) sensibilitatem qmRGA in hypocotylis ad applicationem externam GA auxisse (Figura 3d, e). Contra, fluorescentia mensurata per qd17mRGA in hypocotylo insensibilis erat ad curationem GA3 (Figura 3f, g). Pro utroque experimento, plantulae tractatae sunt cum altis concentrationibus GA (100 μM GA3) ad rapidum comportamentum sensoris aestimandum, ubi facultas ligandi ad receptorem GID1 aucta vel amissa est. Haec inventa simul confirmant biosensorem qmRGA functionem coniunctam tamquam sensoris GA et GA fungi, et suggerunt expressionem differentialem receptoris GID1 emissivitatem sensoris significanter modulare posse.
Adhuc, distributio signorum GA in SAM obscura manet. Quapropter, plantas qmRGA-exprimentes et nuntium cellularum primordialium pCLV3::mCherry-NLS35 adhibuimus ad mappas quantitativas altae resolutionis activitatis signalationis GA calculandas, in strato L1 (epidermide; Fig. 4a, b, vide Methodos et Methodos Supplementares) intendentes, cum L1 partes clavem agit in moderanda accretione SAM36. Hic, expressio pCLV3::mCherry-NLS punctum fixum referentiae geometricum praebuit ad distributionem spatiotemporalem activitatis signalationis GA37 analysandam. Quamquam GA essentialis habetur ad evolutionem organorum lateralium4, observavimus signa GA humiles esse in primordio florali (P) incipiente a stadio P3 (Fig. 4a, b), dum primordia iuvenia P1 et P2 activitatem moderatam similem illi in regione centrali habebant (Fig. 4a, b). Maior activitas signalationis GA detecta est ad limites primordiorum organorum, incipiens a P1/P2 (ad latera limitis) et ad P4 culmen attingens, necnon in omnibus cellulis regionis periphericae inter primordia sitae (Fig. 4a, b et Fig. Suppletoria 8a, b). Haec maior activitas signalationis GA non solum in epidermide sed etiam in stratis L2 et superioribus L3 observata est (Fig. Suppletoria 8b). Exemplar signorum GA in SAM detectorum utens qmRGA etiam per tempus immutatum mansit (Fig. Suppletoria 8c-f, k). Quamquam constructum qd17mRGA systematice deminutum est in SAM plantarum T3 ex quinque stirpibus independentibus quas accurate descripsimus, exemplaria fluorescentiae cum constructo pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP obtenta analysare potuimus (Fig. Suppletoria 8g-j, l). In hac linea moderatrice, tantum mutationes leves in ratione fluorescentiae in SAM detectae sunt, sed in centro SAM claram et inexpectatam diminutionem in VENUS cum TagBFP associatam observavimus. Hoc confirmat exemplar signalationis a qmRGA observatum degradationem GA-dependentem mRGA-VENUS reflectere, sed etiam demonstrat qmRGA fortasse activitatem signalationis GA in centro meristematis superaestimare. In summa, nostrae conclusiones exemplar signalationis GA revelant quod imprimis distributionem primordiorum reflectit. Haec distributio regionis interprimordialis (IPR) debetur gradatim constitutioni altae activitatis signalationis GA inter primordium crescens et regionem centralem, dum eodem tempore activitas signalationis GA in primordio decrescit (Fig. 4c, d).
Distributio receptorum GID1b et GID1c (vide supra) suggerit expressionem differentialem receptorum GA adiuvare ad formandum exemplar activitatis signalationis GA in SAM. Quaesivimus num accumulatio differentialis GA implicata esset. Ad hanc possibilitatem investigandam, sensorem nlsGPS1 GA FRET21 usi sumus. Frequentia activationis aucta detecta est in SAM nlsGPS1 tractati cum 10 μM GA4+7 per 100 min (Figura Supplementaria 9a-e), indicans nlsGPS1 respondere mutationibus in concentratione GA in SAM, sicut facit in radicibus21. Distributio spatialis frequentiae activationis nlsGPS1 revelavit gradus GA relative humiles in stratis externis SAM, sed ostendit eos elevatos esse in centro et ad fines SAM (Figura 4e et Figura Supplementaria 9a,c). Hoc suggerit GA etiam distribui in SAM cum exemplari spatiali comparabili ei quod revelatum est a qmRGA. Methodo complementaria, SAM etiam cum GA fluorescente (GA3-, GA4-, GA7-Fl) vel Fl solo ut moderatore negativo tractavimus. Signum Fl per SAM distributum est, regione centrali et primordio inclusis, quamvis minore intensitate (Fig. 4j et Fig. Supplementaria 10d). Contra, omnes tres GA-Fl intra fines primordii et variis gradibus in reliqua IPR accumulabantur, cum GA7-Fl in maximo dominio IPR accumulante (Fig. 4k et Fig. Supplementaria 10a,b). Quantificatio intensitatis fluorescentiae revelavit rationem intensitatis IPR ad non-IPR maiorem esse in SAM GA-Fl tractato comparato cum SAM Fl tractato (Fig. 4l et Fig. Supplementaria 10c). Haec simul eventa suggerunt GA in maioribus concentrationibus praesens esse in cellulis IPR quae proxime ad limitem organi sitae sunt. Hoc suggerit exemplar actionis signalationis GA in SAM et ex differentiali expressione receptorum GA et ex differentiali accumulatione GA in cellulis IPR prope fines organorum provenire. Itaque nostra analysis exemplar spatiotemporale signalationis GA inexpectatum revelavit, cum minore activitate in centro et primordio SAM et maior activitate in IPR in regione peripherica.
Ut munus actionis signalationis GA differentialis in SAM intellegeretur, correlationem inter actionem signalationis GA, expansionem cellularem, et divisionem cellularem per imagines temporis realis SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS analyzavimus. Dato munere GA in regulatione incrementi, correlatio positiva cum parametris expansionis cellularis exspectata erat. Quapropter, primum mappas actionis signalationis GA cum mappis celeritatis incrementi superficiei cellularis (quasi indicium roboris expansionis cellularis pro cellula data et pro cellulis filialibus in divisione) et cum mappis anisotropiae incrementi, quae directionalitatem expansionis cellularis metiuntur (etiam hic pro cellula data et pro cellulis filialibus in divisione adhibita; Fig. 5a,b, vide Methodos et Methodos Supplementares), comparavimus. Nostrae mappae celeritatis incrementi superficiei cellularis SAM cum observationibus prioribus38,39 congruunt, cum minimis celeritatibus incrementi ad marginem et maximis celeritatibus incrementi in floribus crescentibus (Fig. 5a). Analysis principalis componentium (PCA) demonstravit actionem signalationis GA negative correlatam esse cum intensitate incrementi superficiei cellularis (Figura 5c). Demonstravimus etiam axes variationis principales, inter quos input signalationis GA et intensitas accretionis, orthogonales esse directioni determinatae ab alta expressione CLV3, confirmantes exclusionem cellularum e centro SAM in reliquis analysibus. Analysis correlationis Spearman eventus PCA confirmavit (Figura 5d), indicando altiora signa GA in IPR non effecisse maiorem expansionem cellularem. Attamen, analysis correlationis ostendit levem correlationem positivam inter actionem signalationis GA et anisotropiam accretionis (Figura 5c, d), suggerens altiorem signalationem GA in IPR influere directionem accretionis cellularis et fortasse positionem plani divisionis cellularis.
a, b Tabulae caloris mediae accretionis superficialis (a) et anisotropiae accretionis (b) in SAM per septem plantas independentes mediatae (ut indicia pro robore et directione expansionis cellularis, respective, adhibitae). c Analysis PCA has variabiles inclusit: signum GA, intensitatem accretionis superficialis, anisotropiam accretionis superficialis, et expressionem CLV3. Pars 1 PCA plerumque negative correlata erat cum intensitate accretionis superficialis et positive correlata cum signo GA. Pars 2 PCA plerumque positive correlata erat cum anisotropia accretionis superficialis et negative correlata cum expressione CLV3. Percentationes variationem a singulis componentibus explicatam repraesentant. d Analysis correlationis Spearman inter signum GA, intensitatem accretionis superficialis, et anisotropiam accretionis superficialis ad scalam textus excludendo CZ. Numerus a dextra est valor rho Spearman inter duas variabiles. Asterisci casus indicant ubi correlatio/correlatio negativa valde significativa est. e Visualizatio 3D cellularum Col-0 SAM L1 per microscopiam confocalem. Novi parietes cellulares in SAM (sed non primordio) ad 10 horas formati secundum valores angulorum suorum colorantur. Barra colorum in angulo dextro inferiore monstratur. Insertio imaginem tridimensionalem correspondentem ad 0 horas ostendit. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. f Diagrammata capsularia rates divisionis cellularis in IPR et non-IPR Col-0 SAM (n = 10 plantae independentes) ostendunt. Linea media medianam ostendit, et limites capsularum percentiles 25 et 75 indicant. Vibrae valores minimos et maximos programmate R determinatos indicant. Valores P cum t-teste bicaudato Welch obtenti sunt. g, h Diagramma schematicum ostendens (g) quomodo angulus novae parietis cellularis (magenta) respectu directionis radialis a centro SAM (linea alba punctata) metiri (solum valores anguli acuti, i.e., 0–90°, considerantur), et (h) directiones circumferentiales/laterales et radiales intra meristema. i Histogrammata frequentiae orientationis plani divisionis cellularis trans SAM (caeruleum obscurum), IPR (caeruleum medium), et non-IPR (caeruleum clarum), respective. Valores P per probationem Kolmogorov-Smirnov bicaudam obtenti sunt. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. j Histogrammata frequentiae orientationis plani divisionis cellularis IPR circa P3 (viridis dilutus), P4 (viridis medius), et P5 (viridis obscurus), respective. Valores P per probationem Kolmogorov-Smirnov bicaudam obtenti sunt. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus.
Quapropter, deinde correlationem inter signalationem GA et actionem divisionis cellularis investigavimus, parietes cellulares nuper formatos per experimentum identificando (Fig. 5e). Haec methodus nobis permisit ut frequentiam et directionem divisionis cellularis metiremur. Mirum in modum, invenimus frequentiam divisionum cellularum in IPR et reliqua SAM (non-IPR, Fig. 5f) similem esse, quod indicat differentias in signalatione GA inter cellulas IPR et non-IPR divisionem cellularem significanter non afficere. Hoc, et correlatio positiva inter signalationem GA et anisotropiam accretionis, nos impulit ut consideraremus num activitas signalationis GA orientationem plani divisionis cellularis afficere posset. Orientationem novae parietis cellularis mensuravimus ut angulum acutum respectu axis radialis, centrum meristematis et centrum novae parietis cellularis connectentem (Fig. 5e-i), et manifestam inclinationem cellularum ad dividendum ad angulos propinquos 90° respectu axis radialis observavimus, cum frequentiis maximis observatis ad 70–80° (23.28%) et 80–90° (22.62%) (Fig. 5e,i), quae divisionibus cellularum in directione circumferentiali/transversa correspondent (Fig. 5h). Ut contributionem signalationis GA ad hunc modum divisionis cellularis examinaremus, parametra divisionis cellularis in IPR et non-IPR separatim analyzavimus (Fig. 5i). Observavimus distributionem anguli divisionis in cellulis IPR differre ab ea in cellulis non-IPR vel in cellulis totius SAM, cum cellulis IPR maiorem proportionem divisionum cellularum lateralium/circularium exhibentibus, id est, 70–80° et 80–90° (33.86% et 30.71%, respective, proportiones correspondentes) (Fig. 5i). Itaque observationes nostrae associationem inter signalationem GA altam et orientationem plani divisionis cellularis prope directionem circumferentialem revelaverunt, similem correlationi inter actionem signalationis GA et anisotropiam accretionis (Fig. 5c, d). Ut conservationem spatialem huius associationis ulterius stabiliremus, orientationem plani divisionis in cellulis IPR circum primordium incipiendo a P3 mensuravimus, cum maxima activitas signalationis GA in hac regione detecta sit incipiendo a P4 (Fig. 4). Anguli divisionis IPR circa P3 et P4 nullas differentias statistice significantes ostenderunt, quamquam frequentia aucta divisionum cellularum lateralium in IPR circa P4 observata est (Fig. 5j). In cellulis IPR autem circa P5, differentia in orientatione plani divisionis cellularis statistice significativa facta est, cum incremento frequentiae divisionum cellularum transversarum acuto (Fig. 5j). Haec omnia simul suggerunt signalationem GA posse orientationem divisionum cellularum in SAM moderari, quod congruit cum relationibus prioribus40,41 qui significant signalationem GA altam orientationem lateralem divisionum cellularum in IPR inducere posse.
Praedicitur cellulas in IPR non in primordiis sed potius in internodia incorporari2,42,43. Orientatio transversalis divisionum cellularum in IPR fortasse ordinationem typicam ordinum longitudinalium parallelorum cellularum epidermalum in internodiis efficere potest. Observationes nostrae supra descriptae suggerunt signalationem GA verisimiliter munus agere in hoc processu per directionem divisionis cellularis regulandam.
Functionis amissio plurium genorum DELLA responsum GA constitutivum efficit, et mutantes della ad hanc hypothesim probandam adhiberi possunt44. Primum exemplaria expressionis quinque genorum DELLA in SAM analyzavimus. Fusio transcriptionalis lineae GUS45 revelavit GAI, RGA, RGL1, et RGL2 (multo minore gradu) in SAM expressa esse (Figura Suppletoria 11a-d). Hybridatio in situ porro demonstravit mRNA GAI speciatim in primordiis et floribus crescentibus accumulari (Figura Suppletoria 11e). MRNA RGL1 et RGL3 per totum tectum SAM et in floribus vetustioribus detecta sunt, dum mRNA RGL2 abundantius erat in regione marginis (Figura Suppletoria 11f-h). Imago confocalis pRGL3::RGL3-GFP SAM expressionem per hybridationem in situ observatam confirmavit et demonstravit proteinum RGL3 in parte centrali SAM accumulari (Figura Suppletoria 11i). Usi linea pRGA::GFP-RGA, etiam invenimus proteinum RGA in SAM accumulari, sed eius abundantiam ad limitem decrescere incipiendo a P4 (Figura Supplementaria 11j). Notandum est exemplaria expressionis RGL3 et RGA congruere cum altiore activitate signalationis GA in IPR, ut detecta est per qmRGA (Figura 4). Praeterea, haec data indicant omnes DELLAs in SAM expressum esse et earum expressionem collective totum SAM complecti.
Deinde parametros divisionis cellularis in SAM typi naturalis (Ler, testis) et mutantibus gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Fig. 6a, b) analyzavimus. Curiose, mutationem statisticam significantem in distributione frequentiarum angulorum divisionis cellularis in SAM mutante della globali comparata cum typo naturali observavimus (Fig. 6c). Haec mutatio in mutante della globali debita est incremento frequentiae angulorum 80–90° (34.71% vs. 24.55%) et, minore gradu, angulorum 70–80° (23.78% vs. 20.18%), id est, correspondentium divisionibus cellularibus transversis (Fig. 6c). Frequentia divisionum non-transversarum (0–60°) etiam inferior erat in mutante della globali (Fig. 6c). Frequentia divisionum cellularum transversarum significanter aucta est in SAM mutantis della globalis (Fig. 6b). Frequentia divisionum cellularum transversarum in IPR etiam altior erat in mutante globali della comparato cum typo naturali (Fig. 6d). Extra regionem IPR, typus naturalis distributionem aequabiliorem angulorum divisionis cellularis habuit, cum mutans globalis della divisiones tangentiales sicut IPR praeferret (Fig. 6e). Etiam orientationem divisionum cellularum in SAM mutantium quintuplarum ga2 oxidasis (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, et ga2ox6-2) quantificavimus, quod est genus mutantium GA-inactivum in quo GA accumulatur. Congruenter cum incremento graduum GA, SAM inflorescentiae mutantis quintuplae ga2ox maior erat quam ea Col-0 (Figura Supplementaria 12a, b), et comparata cum Col-0, SAM quintupla ga2ox distributionem angulorum divisionis cellularis distincte diversam ostendit, frequentia angulari a 50° ad 90° crescente, i.e. iterum divisiones tangentiales favente (Figura Supplementaria 12a-c). Ita demonstramus activationem constitutivam signalationis GA et accumulationem GA divisiones cellulares laterales in IPR et reliqua SAM inducere.
a, b Visualisatio tridimensionalis strati L1 SAM Ler (a) PI-tinctae et SAM mutantis della globalis (b) per microscopiam confocalem. Novae parietes cellularum in SAM (sed non primordio) per spatium 10 horarum formatae monstrantur et secundum valores angulorum colorantur. Insertio SAM ad 0 horas ostendit. Vectis colorum in angulo dextro inferiore monstratur. Sagitta in (b) exemplum fasciculorum cellularum alignatorum in mutante della globali indicat. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. Comparatio distributionis frequentiae orientationum plani divisionis cellularis in toto SAM (d), IPR (e), et non-IPR (f) inter Ler et della globale. Valores P per probationem Kolmogorov-Smirnov bicaudatam obtenti sunt. f, g Visualisatio tridimensionalis imaginum confocalium SAM PI-tinctae plantarum transgenicarum Col-0 (i) et pCUC2::gai-1-VENUS (j). Tabulae (a, b) novas parietes cellulares (sed non primordiis) in SAM intra 10 horas formatas ostendunt. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. h–j Comparatio distributionis frequentiae orientationum plani divisionis cellularis in toto SAM (h), IPR (i) et non-IPR (j) inter plantas Col-0 et pCUC2::gai-1-VENUS. Valores P per probationem Kolmogorov–Smirnov bicaudatam obtenti sunt.
Deinde effectum inhibitionis signalationis GA specifice in IPR exploravimus. Ad hoc, promotorem cotyledon cup 2 (CUC2) adhibuimus ad expressionem proteini gai-1 negativi dominantis, cum VENUS coniuncti (in linea pCUC2::gai-1-VENUS) impellendam. In SAM typi naturalis, promotor CUC2 expressionem plurimorum IPR in SAM, cellulis marginibus inclusis, a P4 deinceps impellit, et similis expressio specifica in plantis pCUC2::gai-1-VENUS observata est (vide infra). Distributio angulorum divisionis cellularis trans SAM vel IPR plantarum pCUC2::gai-1-VENUS non significanter differt ab ea typi naturalis, quamquam inopinato invenimus cellulas sine IPR in his plantis frequentia altiore 80-90° dividi (Fig. 6f-j).
Suggestum est directionem divisionis cellularum pendere ex geometria SAM, praesertim ex tensione tensile generata a curvatura textus46. Ideo quaesivimus num forma SAM mutata esset in plantis della globalis mutante et pCUC2::gai-1-VENUS. Ut antea relatum est12, magnitudo SAM mutantis della globalis maior erat quam typi naturalis (Figura Supplementaria 13a, b, d). Hybridatio in situ CLV3 et STM RNA expansionem meristematis in mutantibus della confirmavit et porro expansionem lateralem nichi cellularum primordialium ostendit (Figura Supplementaria 13e, f, h, i). Tamen, curvatura SAM similis erat in utroque genotypo (Figura Supplementaria 13k, m, n, p). Similem augmentum magnitudinis observavimus in mutante quadruplici della gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 sine mutatione curvaturae comparata cum typo naturali (Figura Supplementaria 13c, d, g, j, l, o, p). Frequentia orientationis divisionis cellularis etiam in mutante quadruplici della affecta est, sed minus quam in mutante monolithico della (Figura Suppletoria 12d-f). Hic effectus dosis, una cum absentia effectus in curvaturam, suggerit residuam activitatem RGL3 in mutante quadruplici Della mutationes in orientatione divisionis cellularis, quae amissa activitate DELLA causantur, limitare et mutationes in divisionibus lateralibus cellularum in responsione ad mutationes in activitate signalationis GA potius quam ad mutationes in geometria SAM fieri. Ut supra descriptum est, promotor CUC2 expressionem IPR in SAM incipiens a P4 impellit (Figura Suppletoria 14a, b), et contra, pCUC2::gai-1-VENUS SAM magnitudinem reductam sed curvaturam maiorem habuit (Figura Suppletoria 14c-h). Haec mutatio in morphologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM distributionem tensionum mechanicarum diversam comparatam cum typo naturali efficere potest, in quo tensiones circumferentiales altae breviore distantia a centro SAM incipiunt47. Aliter, mutationes in morphologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM ex mutationibus proprietatum mechanicarum regionalium, ab expressione transgeni inductis, oriri possunt48. In utroque casu, hoc effectus mutationum in signalatione GA partim compensare potest, augendo probabilitatem cellularum in orientatione circumferentiali/transversa dividendarum, quod observationes nostras explicat.
Data nostra, simul sumpta, confirmant signalationem GA altiorem partes activas agere in orientatione laterali plani divisionis cellularis in IPR. Ostendunt etiam curvaturam meristemi orientationem plani divisionis cellularis in IPR afficere.
Transversa orientatio plani divisionis in IPR, propter magnam activitatem signalationis GA, suggerit GA fasciculum cellularum radialem in epidermide intra SAM prae-organizare ad ordinationem cellularem definiendam quae postea in internodio epidermali invenietur. Revera, tales fasciculi cellularum saepe visibiles erant in imaginibus SAM mutantium della globalium (Fig. 6b). Itaque, ut functionem evolutionalem exemplaris spatialis signalationis GA in SAM ulterius exploraremus, imagines temporis-lapsus adhibuimus ad ordinationem spatialem cellularum in IPR in plantis typi naturalis (Ler et Col-0), mutantibus della globalibus, et plantis transgenicis pCUC2::gai-1-VENUS analysandam.
Invenimus qmRGA demonstravisse actionem signalationis GA in IPR augeri ab P1/P2 et culmen ad P4 pervenisse, et hanc figuram constans per tempus mansisse (Fig. 4a-f et Fig. Suppletoria 8c-f, k). Ad ordinationem spatialem cellularum in IPR cum crescente signo GA analysandam, cellulas IPR Ler supra et ad latera P4 secundum fatum earum evolutionale, analysatum 34 horis post primam observationem, id est, plus quam bis temporibus plastidi, designavimus, quod nobis permisit cellulas IPR sequi per evolutionem primordii ab P1/P2 ad P4. Tribus coloribus diversis usi sumus: flavo pro iis cellulis quae in primordium prope P4 integratae sunt, viridi pro iis quae in IPR erant, et purpureo pro iis quae in utroque processu participaverunt (Fig. 7a-c). Ad t0 (0 h), 1-2 strata cellularum IPR ante P4 visibilia erant (Fig. 7a). Ut expectatum, cum hae cellulae dividebantur, id fecerunt praesertim per planum divisionis transversum (Fig. 7a-c). Similia eventa per Col-0 SAM consecuta sunt (in P3, cuius limes similiter ac P4 in Ler plicatur, intendentes), quamquam in hoc genotypo plica ad limes floralis formata cellulas IPR celerius celavit (Fig. 7g-i). Itaque, modus divisionis cellularum IPR cellulas in ordines radiales, ut in internodiis, prae-organizat. Ordinatio ordinum radialium et localizatio cellularum IPR inter organa successiva suggerunt has cellulas esse progenitores internodales.
Hic, biosensorem ratiometricum signalationis GA, qmRGA, elaboravimus, qui mappationem quantitativam activitatis signalationis GA ex coniunctis concentrationibus GA et receptorum GA resultantis permittit, interferentiam cum viis signalationis endogenis minuens, ita informationem de functione GA in gradu cellulari praebens. Ad hunc finem, proteinum DELLA modificatum, mRGA, construximus, quod facultatem amisit ligandi socios interactionis DELLA sed sensibile manet ad proteolysin a GA inductam. qmRGA respondet mutationibus tam exogenis quam endogenis in gradibus GA, et eius proprietates sensuum dynamicae permittunt aestimationem mutationum spatiotemporalium in activitate signalationis GA per evolutionem. qmRGA etiam instrumentum valde flexibile est, cum adaptari possit ad diversos textus mutando promotorem ad eius expressionem adhibitum (si necesse est), et data natura conservata viae signalationis GA et motivi PFYRE trans angiospermas, verisimile est ut transferri possit ad alias species22. Hoc congruenter, mutatio aequivalens in proteino oryzae SLR1 DELLA (HYY497AAA) etiam ostensa est actionem repressoris crescentiae SLR1 supprimere, dum degradationem eius GA-mediatam leviter tantum reducebat, simile mRGA23. Notandum est studia recentiora in Arabidopsis demonstravisse mutationem unius aminoacidi in dominio PFYRE (S474L) actionem transcriptionalem RGA mutasse sine detrimento facultatis eius interactionis cum sociis factorum transcriptionis50. Quamquam haec mutatio tribus substitutionibus aminoacidis praesentibus in mRGA proxima est, studia nostra ostendunt has duas mutationes proprietates distinctas DELLA mutare. Quamquam plerique socii factorum transcriptionis ad dominia LHR1 et SAW DELLA26,51 ligant, quaedam aminoacida conservata in dominio PFYRE has interactiones stabiliere possunt.
Incrementum internodii est nota clavis in architectura plantarum et augmentatione proventus. qmRGA maiorem activitatem signalationis GA in cellulis progenitoribus internodii IPR revelavit. Combinando imagines quantitativas et geneticam, demonstravimus exempla signalationis GA plana divisionis cellularum circularia/transversa in epidermide SAM superponere, ordinationem divisionis cellularum necessariam ad evolutionem internodii formantes. Plures regulatores orientationis plani divisionis cellularum per evolutionem identificati sunt52,53. Opus nostrum exemplum clarum praebet quomodo activitas signalationis GA hunc parametrum cellularem regulat. DELLA cum complexibus proteinorum praeplicationis interagere potest41, ita signalatio GA orientationem plani divisionis cellularum moderari potest per directam influentiam orientationis microtubulorum corticalium40,41,54,55. Insperate demonstravimus in SAM, correlatum maioris activitatis signalationis GA non elongationem vel divisionem cellularum, sed solum anisotropiam accretionis fuisse, quod congruit cum effectu directo GA in directionem divisionis cellularum in IPR. Tamen, non possumus excludere hunc effectum etiam indirectum esse posse, exempli gratia mediatum per mollitiem parietis cellularis ab GA inductam56. Mutationes in proprietatibus parietis cellularis tensionem mechanicam inducunt57,58, quae etiam orientationem plani divisionis cellularis afficere potest per afficiendum orientationem microtubulorum corticalium39,46,59. Effectus coniuncti tensionis mechanicae a GA inductae et regulationis directae orientationis microtubulorum per GA fortasse implicantur in generando exemplari specifico orientationis divisionis cellularis in IPR ad definiendos internodia, et studia ulteriora necessaria sunt ad hanc ideam probandam. Similiter, studia priora momentum proteinorum DELLA-interagentium TCP14 et 15 in moderatione formationis internodii60,61 illustraverunt et hi factores actionem GA una cum BREVIPEDICELLO (BP) et PENNYWISE (PNY) mediari possunt, quae evolutionem internodii regulant et demonstratum est signalationem GA afficere2,62. Cum DELLAe cum viis signalationis brassinosteroidum, aethyleni, acidi jasmonici, et acidi abscissici (ABA) interagant63,64 et cum haec hormona orientationem microtubulorum afficere possint65, effectus GA in orientatione divisionis cellularum etiam ab aliis hormonibus mediari possunt.
Studia cytologica priora demonstraverunt regiones et internas et externas SAM Arabidopsis ad evolutionem internodii requiri2,42. Quod GA active divisionem cellularum in textibus internis12 moderatur, duplicem functionem GA in regulanda magnitudine meristemi et internodii in SAM confirmat. Modus divisionis cellularis directionalis etiam arcte regulatur in textu SAM interno, et haec regulatio essentialis est ad incrementum caulis52. Interest examinare num GA etiam munus sustineat in orientando plano divisionis cellularis in organizatione SAM interna, ita synchronizando specificationem et evolutionem internodiorum intra SAM.
Plantae *in vitro* in solo vel medio Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) cum 1% saccharosa et 1% agaro (Sigma) sub condicionibus normalibus (16 h lucis, 22°C) supplemento cultae sunt, exceptis experimentis hypocotyli et radicum crescentiae in quibus plantulae in laminis verticalibus sub luce constanti et 22°C cultae sunt. Pro experimentis nitratis, plantae in medio MS modificato (bioWORLD plant medium) cum nitrato adaequato (0 vel 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinato, 1% saccharosa et 1% A-agaro (Sigma) sub condicionibus diei longi supplemento cultae sunt.
cDNA GID1a in pDONR221 insertum cum pDONR P4-P1R-pUBQ10 et pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW recombinatum est ad pUBQ10::GID1a-mCherry generandum. DNA IDD2 in pDONR221 insertum in pB7RWG266 recombinatum est ad p35S:IDD2-RFP generandum. Ad pGID1b::2xmTQ2-GID1b generandum, fragmentum 3.9 kb ante regionem codificantem GID1b et fragmentum 4.7 kb cDNA GID1b (1.3 kb) et terminatorem (3.4 kb) continens primum amplificata sunt utens initiis in Tabula Supplementi 3, deinde in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) et pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) respective inserta, et denique cum pDONR221 2xmTQ268 in vectorem scopum pGreen 012567 utens clonatione Gateway recombinata sunt. Ad pCUC2::LSSmOrange generandum, sequentia promotoris CUC2 (3229 bp ante ATG), deinde sequentia codificans magni Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 cum signo localizationis nuclearis N7 et terminatore transcriptionis NOS, in vectorem pGreen kanamycin dirigens composita est, utens systemate recombinationis Gateway 3-fragmentorum (Invitrogen). Vector binarius plantae in stirpem Agrobacterium tumefaciens GV3101 introductus est, et in folia Nicotianae benthamianae per methodum infiltrationis Agrobacterium et in Arabidopsis thaliana Col-0 per methodum immersionis floralis, respective. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry et pCLV3::mCherry-NLS qmRGA, ex progenie F3 et F1 hybridizationis, respective, isolata sunt.
Hybridisatio RNA in situ in apicibus surculorum circiter 1 cm longis peracta est72, quae collecta et statim in solutione FAA (3.7% formaldehydi, 5% acidi acetici, 50% ethanoli) prae-refrigerata ad 4°C fixa sunt. Post curationes in vacuo bis × 15 min, fixativum mutatum est et exempla per noctem incubata sunt. cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, et RGL3 et probationes antisensus ad eorum 3′-UTRs synthesizatae sunt utens initiis in Tabella Supplementi 3 monstratis, ut a Rosier et al. descriptum est73. Specillae digoxigenino signatae immunodetectatae sunt anticorporibus digoxigenini (dilutio 3000-plicis; Roche, numerus catalogi: 11 093 274 910) utentes, et sectiones tinctae sunt solutione 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatis (BCIP, dilutio 250-plicis)/nitrocaerulei tetrazolii (NBT, dilutio 200-plicis).
Tempus publicationis: Feb-10-2025