Germen apicale meristem (SAM) incrementum criticum est ad architecturam caulis. Plant hormonesgibberellins(GAs) munere funguntur in incrementum plantae componendae, sed partes eorum in SAM male intellectae manet. Hic biosensorem GA ratiometricum evolvit significans dapibus DELLA machinando ut munus suum essentiale regulatorii in GA transcribenda supprimeret, servata degradatione in GA recognitionem. Demonstremus hanc degradationem biosensorem subnixam accurate commemorat mutationes in GA in gradibus et in evolutione sentiendi cellulares. Hoc biosensore usi sumus ad GA designandum activitatem in SAM describendam. Demonstremus signa alta GA inesse praecipue in cellulis inter organum primordia collocatum, quae sunt praecursores ad cellulas internodias. Utendo quaestum ac detrimentum accedente munere, ulterius demonstramus GA moderari orientationem plani cellae divisionis, institutionem cellularum internodium canonicam instituere, inde specificationem internodium in SAM promovere.
Surculus apicalis meristem (SAM), ad apicem germen situs, angulum caulis cellarum continet cuius actio organa lateralia et nodos caulis generat modo modulari et iterative per totam vitam plantae. Quaelibet illarum iteratio unitatum seu nodis plantarum includit internodia et organa lateralia ad nodos, et meristemas axillares in axillis foliorum. Incrementum et ordo nodis plantae per progressionem mutat. In Arabidopsis, incrementum internodalum in statu vegetativo supprimitur, et meristemae axillares sopitant in axillis rosae foliorum. Per transitum ad periodum floralem, SAM fit inflorescentia meristema, internodia elongata generans et gemmas axillares, ramulos in axillis foliorum caulinorum, et postea sine frondibus florum. Etsi multum progressum fecerimus ad intellegendas machinas quae initiationem foliorum, florum et ramorum regunt, parum notum est quomodo internodia oriuntur relative.
Intelligentes spatiotemporalem distributionem GAs adiuvabit ut functiones harum hormonum in diversis texturis et in diversis evolutionis gradibus melius cognoscatur. Visualization degradationis fusionis RGA-GFP expressae sub actione auctoris sui momenti praebet informationem in regula totalis GA gradus in radicibus 15.16. Sed expressio RGA per tela variat 17 et regitur a GA18. Sic expressio differentialis promotoris RGA provenire potest in forma fluorescens observata cum RGA-GFP et sic hic modus quantitatis non est. Recentius bioactivum fluorescein (Fl) - intitulatum GA19,20 coacervationem GA in endocortex radicis patefecit et regulam cellularum suarum per GA onerariam patefecit. Nuper GA FRET sensorem nlsGPS1 monstravit quod GA aequat cum cellularum elongatione in radicibus, filamentis et hypocotyls atro-cretis, referunt. Nihilominus, ut vidimus, GA intentio non est solus modulus moderatus GA actionem significativam, sed a sensibilibus processibus implicatis pendet. Hic, aedificantes in intellectu nostro DELLA et GA vias significantes, nuntiamus progressum et characterem degradationis substructae ratiometricae biosensoris GA significationis. Ad hanc quantitatem biosensorem evolvendam, mutant GA sensitivum RGA quod dapibus fluorescentibus conflatum et ubiquite in fibris exprimitur, ac interdum GA insensibili fluorescenti usus est. Ostendimus fusiones interdum mutant RGA non impediunt endogenosas GA significantes ubi ubiquite exprimuntur, et hunc biosensorem quantitare posse significans actionem ex utroque GA input et GA processus signo dato per apparatum sensibilem cum magno spatiotemporali resolutione. Hoc biosensore usi sumus ad describendam spatiotemporalem distributionem GA significandi navitatis et quantitatis quomodo GA mores cellularum in SAM epidermide moderetur. Demonstremus GA moderari ordinationem plani divisionis cellularum SAM inter organi primordia sitae, ita definiens institutionem cellularum interniodi canonicam.
Denique quaesivimus num qmRGA referre posset mutationes in endogenosis GA gradibus utendo hypocotylis crescentibus. Antea demonstravimus nitras incrementum GA synthesin augendo et vicissim degradationem DELLA34 stimulare. Quocirca animadvertimus hypocotylum longitudinem in pUBQ10::qmRGA semina sub uberi copia nitratis 10 mM NO3− crevisse, insigniter longiorem fuisse quam in plantis sub conditionibus nitrate deficientibus (supplementary Fig. 6a). Cum responsione incrementi congruentes, GA signa altiora erant in hypocotylis seminum sub conditionibus 10 mM NO3− crevit, quam in plantationibus in absentia nitrate creverunt (supplementary Fig. 6b, c). Quapropter, qmRGA etiam efficit vigilantiam mutationum in GA significans inductas endogenosas in GA intentiones mutationes.
Ad intelligendum utrum GA significans actionem qmRGA deprehensam ab GA intentione et GA perceptione pendeat, secundum exspectationem in consilio sensoriis, explicavimus expressionem trium receptorum GID1 in textuum vegetativorum et generationis. In plantationibus GID1-GUS notario linea monstravit GID1a et c in cotyledonibus valde expressa (Fig. 3a-c). In foliis praeterea omnes tres receptores expressi sunt, radix lateralis primordia, apices radix (praeter pileum radicis GID1b), et systema vascularium (fig. 3a-c). In inflorescentiis SAM, deprehendimus GUS tantum significationibus GID1b et 1c (supplementum Fig. 7a-c). In situ hybridizationis haec exemplaria expressa confirmarunt et ulterius demonstraverunt GID1c aequabiliter in humili gradu in SAM fuisse expressum, cum GID1b altiorem expressionem in peripheria SAM (supplentariae Fig. 7d-l). Fusio translationalis pGID1b::2xmTQ2-GID1b etiam manifestavit gradatim expressionis GID1b, ab humili vel nulla expressione in centro SAM ad altam expressionem in organi finibus (Supplem. Fig. 7m). Sic receptores GID1 trans et intra fibras uniformiter distribuuntur. In experimentis subsequentibus etiam animadvertimus overexpressionem GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) auctam esse sensitivum qmRGA in hypocotylis ad applicationem externam GA (Fig. 3d, e). At contra fluorescens in hypocotylo mensurata qd17mRGA curatio GA3 insensibilis erat (Fig. 3f, g). Ambo enim pertentationes, plantationes cum concentratione alto GA (100 μM GA3) tractatae sunt ad mores sensoris celeris aestimandi, ubi facultas ligandi receptori GID1 aucta vel amissa est. Simul, hi eventus confirmant qmRGA biosensoris functioni coniunctae uti GA et GA sensori inservire, et suggerere differentialem receptoris GID1 expressionem signanter emissionem sensoris modulare posse.
Ad diem distributio GA significationum in SAM obscura manet. Propterea qmRGA exprimentes plantas et pCLV3::mCherry-NLS plantas exprimentes et notario35 cellulae notarii 35 computare altam solutionem quantitatis tabularum GA significantem actionem, in strato L1 (epidermi, Fig. 4a, b, vide Methodos et Methodos accessiones) computare, cum L1 partes praecipui ponderis SAM incrementi moderandi ludit. Hic, pCLV3::mCherry-NLS expressio praebebat punctum fixum geometricae notae, ut dividendo spatiotemporalem distributionem GA significandi activitatem37. Etsi GA essentialis consideretur pro evolutione organi lateralis 4, animadvertimus GA signa humiles esse in primordio florali (P) incipiendo a P3 stadio (Fig. 4a, b), cum iuvenibus P1 et P2 primordiums mediocrem activitatem similem in regione media habuisse (Fig. 4a, b). Superior GA actio significans in organo primordium limitum deprehensa est, incipiens a P1/P2 (ad latera limitis) et ad P4 tendens, necnon in omnibus cellulis regionis periphericis inter primordia sitae (Fig. 4a, b et Accessiones Fig. 8a, b). Haec superior GA significativa actio observata est non solum in epidermide, sed etiam in L2 et L3 in stratis superioribus (Supplem. Fig. 8b). Exemplar GA significationum in SAM detectae utens qmRGA etiam supra tempus immutata permansit (supplementum Fig. 8c-f, k). Etsi constructio qd17mRGA in SAM of T3 plantarum e quinque lineis independens, quas singillatim notavimus, systematice ordinatum erat, exemplaria fluorescentem cum pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP comparata resolvere potuimus (Supplem. Fig. 8g-j, l). In hac potestate recta, tantum mutationes minores in ratione fluorescentiae in SAM detectae sunt, at in centro SAM claram et inopinatam decre- tionem in VENUS cum TagBFP associato animadvertimus. Hoc confirmat signum signum a qmRGA observatum reflectere GA dependens degradationem mRGA-VENUS, sed etiam demonstrat qmRGA plus aestimare GA actionem significat in centro meristem. In summa, eventus nostri exemplum significantem GA ostendunt quae primordiae distributionem imprimis refert. Distributio regionis interprimordialis (IPR) provenit gradatim instauratione altae GA, significativae actionis inter primordium progressionem et regionem centralem, dum simul GA significat actionem in primordium decrescit (Fig. 4c, d).
Distributio receptorum GID1b et GID1c (vide supra) indicat expressionem differentialem receptorum GA adiuvat exemplar GA significandi activitatem in SAM figurare. Mirati sumus an cumulus differentialis GA interveniret. Ad hanc facultatem cognoscendam usi sumus nlsGPS1 GA FRET sensor21. Frequentia activationis aucta deprehensa est in SAM of nlsGPS1, tractata cum 10 μM GA4+7 pro 100 min (Fig. 9a-e), significans nlsGPS1 respondere mutationibus in GA intentione in SAM, sicut in radicibus21. Distributio spatii nisGPS1 activationis frequentiae GA gradus in stratis exterioribus SAM relative humilibus revelatur, sed in centro et in finibus SAM elevatos esse ostendit (Fig. 4e et Fig. 9a, c). Hoc suggerit GA distribui etiam in SAM cum exemplaris locali comparando ad illud per qmRGA revelatum. Ad accessionem complementariam, etiam SAM fluorescentibus GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) tractavimus vel Fl solum ut imperium negativum. Signum FL per SAM distributum est, inter regionem centralem et primordium, licet intensio inferiori (Fig. 4j et accessiones Fig. 10d). E contra, omnes tres GA-Fl intra primordium fines specialiter congesti et gradus varios in reliquis IPR, cum GA7-Fl in amplissima dominio in IPR accumulando (Fig. 4k et Fig. 10a, b). Intensio fluorescentiae quantitatis patefecit IPR ad intensionem non-IPR rationem altiorem in GA-Fl affectam SAM comparari ad Fl tractatam SAM (Fig. 4l et accessiones Fig. 10c). Una, hi eventus suggerunt GA praesentem esse coniunctionibus superioribus in cellulis IPR quae proximae ad confinium organi sita est. Hoc innuit exemplum actionis SAM GA significans provenire ex utraque expressione differentiali GA receptorum et cumulatio differentialis GA in cellulis IPR prope limites organi. Ita, nostra analysis inopinatum spatiotemporalem exemplaris GA significandi patefecit, cum inferiore actione in centro ac primordio SAM et altioris actionis in IPR in regione periphericis.
Ut partes differentialis GA activitatem significans in SAM accipias, correlationem inter GA significans activitatem, cellam expansionem et divisionem cellularum utentes temporis reali temporis lapsu imaginis SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Dato munere GA in dispositione augmenti, relatio positiva cum parametri expansione cellularum exspectabatur. Propterea primum comparavimus GA significans mappas activitatem cum mappis cellae superficiei incrementi (sicut procuratorem ad robur expansionis cellae pro data cellula et pro cellulis filiarum divisim) et cum mappis incrementi anisotropy, quae directionalitatem expansionis cellae metitur (etiam hic pro cellula data et pro filiabus cellulis divisis, Fig. 5a, b, vide Methodos et Methodos accessiones). Nostrae tabulae SAM cellae superficiei incrementi congruentes cum observationibus praecedentibus 38,39, cum minimis incrementis in confinio ac maximis incrementis in floribus explicandis (fig. 5a). Analysis principalis componentis (PCA) ostendit GA significans activitatem negative connecti cum incrementi superficiei intensio (Figura 5c). Etiam demonstravimus axes principales variationis, incluso GA, significans input et incrementum intensionem, orthogonales esse ad directionem per altam expressionem CLV3 determinatam, confirmantes exclusionem cellularum a centro SAM in reliquis analysibus. Hastatus correlatio analysis PCA eventus (Figura 5d) confirmavit (Figura 5d), significans altiora GA signa in IPR non provenire in dilatatione cellula superiore. Attamen analysis correlatio parvam affirmativam inter GA significativam actionem et anisotropiam (Figura 5c, d) incrementum patefecit, suggerens altiorem GA significans in IPR directionem incrementi cellae influere et fortasse positio cellae divisionis plani.
a, b Tabulae caloris mediae incrementum superficiei (a) et incrementum anisotropium (b) in SAM Curabitur supra septem plantas independentes (ut procuratores adhibentur ad vim et directionem expansionis cellae respective). c PCA analysis includitur sequentes variabiles: GA signum, incrementum intensio superficiei, incrementum anisotropium superficiei, et expressio CLV3. PCA pars 1 maxime negative connectitur cum incrementi superficiei intensione et positivo cum signo GA connectitur. PCA component 2 maxime positive connectuntur cum incremento superficiei anisotropia et negative cum expressione CLV3 connectenda. Percentages variatio per singulas partes explicata repraesentant. d Analysis Hastatus reciprocus inter GA signum, incrementum intensionem superficiei, et incrementum superficiei anisotropium in scala texti excludens CZ. Numerus dexter est Hastatus rho valor inter binas variabiles. Asterisci casus indicant ubi relativa relatio/negativa valde significant. e 3D visualizationis Col-0 SAM L1 cellularum microscopio confocal. Muri cellulae novae in SAM formatae (non autem primordium) ad 10 h secundum eorum angulum valores colorantur. Color talea in angulo dextro inferiore ostenditur. Fundum ostendit respondentem 3D imaginem in 0 h. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. f Arca machinae in IPR et non-IPR Col-0 SAM (n = 10 plantas independentes) ostendunt. Linea media ostendit medianum, et cistae limites 25 et 75 centies indicant. Whiskers indicant valores minimos et maximos cum R programmate determinatos. P valores cum Welch duo cercopitheci t-test. g, h Schematica schematis ostendens (g) modum angulum novi muri cellae respectu radialis directionis a centro SAM (linea alba punctata) (tantum valorum angulorum acutis, id est 0-90°, considerantur), et (h) partes circumferentiales/laterales et radiales intra meristem. i Frequentia histograms cellulae divisionis plani orientationis trans SAM (caeruleae), IPR (caeruleae mediae), et non-IPR (caeruleae) respective. P valores duo testium caudatorum Kolmogorov-Smirnov consecuti sunt. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. j Frequency histograms of cell division of the plane IPR circa P3 (levis viridis), P4 (medium viride), et P5 (nigrum viridis), respectively. P valores duo testium caudatorum Kolmogorov-Smirnov consecuti sunt. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus.
Proxime igitur quaesivimus rationem inter GA significans et actionem cellam dividendo cognoscendo muros cellulas in primordio noviter formatos (Fig. 5e). Accessus hic nobis conceditur ut metiaris frequentiam et directionem divisionis cellae. Mire invenimus frequentiam divisionum cellularum in IPR et reliquis SAM (non-IPR, Fig. 5f) similem fuisse, ostendens differentias in GA significans inter IPR et non-IPR cellulas non signanter divisionem cellularum afficere. Haec, et relatio positiva inter GA significans et incrementum anisotropium, nos admonuit considerare utrum GA significans actio influere possit in plani cellulae divisionis orientationem. Nos orientationem novi parietis cellae metiri ut angulum acutum relativum ad axi radialem meristem iungentem centrum et centrum novi parietis cellae (Fig. 5e-i) observavimus claram inclinationem cellarum dividendi ad angulos prope 90° relativos ad axem radialem, frequentiis altissimis in 70-80° (23.28%) observatis, et 80-90° (22.62%) et 80-90° (22.62%) (22.62%) et 80-90° (22.62%) observatis frequentiis (22.62) (22.62%) et 80-90° (22.62%) et 80-90° (22.62%) (22.62%) et 80-90° dividendis ad angulos prope 90° relativis ad axem radialem circumferential / directionem transversalem (Fig. 5h). Ad contributionem GA significandam ad hanc cellulam divisionem morum examinandam, parametri cellulas in IPR et non-IPR separatim enucleavimus (Fig. 5i). Animadvertimus divisionem angulum distributionem in cellulis IPR differre ab illa in cellulis non-IPR vel in cellulis in tota SAM, cellulis IPR exhibens divisiones cellularum lateralium/circularum superiorem proportionem, id est 70-80° et 80-90° (33.86% et 30.71%, respective proportionibus respondentibus) (Fig. 5i). Quapropter observationes nostrae declaraverunt consociationem inter altam GA signantem et cellulam divisionem plani orientationis prope circumferentialem directam, similem habitudinem inter GA actionem significativam et anisotropium incrementum (Fig. 5c, d). Ad conservationem localem huius consociationis ulterius stabiliendam, divisionem orientationem plani in cellulis IPR primordium incipiendo ab P3 circumfusis metiri, cum summa GA actio significationis in hac regione ab P4 (Fig. 4) detecta est. Divisio angulorum IPR circa P3 et P4 nullas peraeque differentias significantes ostendit, quamvis aucta frequentia divisionum cellularum lateralium in IPR circa P4 observata sit (Fig. 5j). Attamen in cellulis IPR circa P5, differentia in orientatione divisionis cellulae plani peraeque significans facta est, acuto incremento in frequentia divisionum cellularum transversalium (Fig. 5j). Simul, hi eventus suggerunt GA significans orientationem divisionum cellularum in SAM regere posse, quae cum relationibus praecedentibus 40,41 consentaneum est, altum GA significatum posse inducere laterales orientationis divisiones cellularum in IPR.
Praedixit cellulas in IPR non primordio incorporari, sed potius in internodes2,42,43. orientatio transversa divisionum cellularum in IPR inveniri potest in ordinatione typica ordines cellularum longitudinalium parallelarum in internodibus. Nostrae observationes supra scriptae suggerunt GA significans verisimile munus in hoc processu habere, directionem divisionis cellae moderans.
Amissio functionis plurium DELLA genes consequitur responsionem constitutivam GA, et della mutantes hanc hypothesin probare possunt. DELLA GENERIS quinque exemplaria elocutionis in SAM primum explicavimus. Fusio transcriptionalis GUS line45 patefecit GAI, RGA, RGL1, RGL2 (ad multo minus) in SAM expressa (Supplent. Fig. 11a-d). In situ hybridizationis ulterius demonstratur quod GAI mRNA speciatim accumulat in primordia et flores evolutionis (Supplementary Fig. 11e). RGL1 et RGL3 mRNA per SAM conopeum detectae sunt et in floribus vetustioribus, cum RGL2 mRNA in confinio regionis copiosior erat (Supplementarium Fig. 11f–h). Confocal imaginatio pRGL3::RGL3-GFP SAM confirmavit expressionem in situ hybridizationis observatam et ostendit interdum RGL3 in media parte SAM accumulare (Fig. 11i). Linea pRGA::GFP-RGA adhibita, etiam RGA interdum cumulare in SAM invenimus, sed eius abundantia ad terminum incipientem a P4 decrescit (Fig. 11j). Egregie exemplaria expressionis RGL3 et RGA constantibus superioribus GA activitatem significantem in IPR, qmRGA deprehenduntur (Fig. 4). Haec autem notitia indicata omnia DELLAs in SAM exprimi et eorum expressionem in summa totius SAM enasci.
SAM (Ler, imperium) et gai-t6 rga-i2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutantes (Fig. 6a, b). Interestingly, peraeque notabilem mutationem in distributione globorum divisionis anguli frequentiae in della global mutant SAM comparatae generis silvestribus (fig. 6c). Mutatio haec in della global mutante ob incrementum frequentiae 80-90° angulorum (34.71% vs. 24.55%) et, minus 70-80° angulorum (23.78% vs. 20.18%), id est, divisis cellulis transversis respondens (Fig. 6c). Frequentia divisionum non transversalium (0-60°) etiam inferior in mutante della globali (fig. 6c). Frequentia divisionum cellularum transversalium signanter aucta est in SAM mutante della globali (fig. 6b). Frequentia divisionum cellularum transversalium in IPR etiam altior erat in mutante della globali speciei silvestri (fig. 6d). Extra regionem IPR, genus silvestre magis aequabilius habebat angulorum cellularum divisionem, cum della global mutant divisiones tangentiales sicut IPR praelatas (Fig. 6e). Etiam quantam orientationem divisionum cellularum in quintupla mutante SAM ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, et ga2ox6-2), GA in inactivo mutatur in quo GA accumulat. SAM quintuple GA2ox mutant inflorescentiam maiorem quam Col-0 (Fig. 12a, b), et collato Col-0, quintupla ga2ox SAM distincte diversam divisionem angulorum cellularum, angulo crebrescentium ab 50° ad 90° crescentem (supplementalium divisionum). Ita ostendimus activationem constitutivam GA significans et GA cumulum inducunt divisiones cellularum laterales in IPR et reliquas SAM.
a, b 3D visualisatio L1 lavacri PI-maculati Ler (a) et della mutant globalem (b) SAM microscopio confocal utens. Novae cellulae muri in SAM (non autem primordium) supra tempus 10-h formatum secundum eorum angulum valores ostenduntur et colorantur. Fundum ostendit SAM in 0 h. Color talea in angulo dextro inferiore monstratur. Sagitta in (b) exemplum demonstrat in globulis cellulis varius in della mutant globalem. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. ce comparatione frequentiae distributionis cellae divisionis plane orientationum in totum SAM (d), IPR (e), et non IPR (f) inter Ler et global della. P valoribus duobus caudatus Kolmogorov-Smirnov test. f, g 3D visualisatio imaginum confocalarum PI-maculatae SAM of Col-0 (i) et pCUC2::gai-1-VENUS (j) plantarum transgenicarum. Tabulae (a, b) ostendunt parietes cellulos novos (sed non primordia) formatos in SAM intra 10 h. Experimentum bis repetitum est cum similibus eventibus. h-j Comparatio frequentiae distributionis divisionis cellularum planarum orientationum in tota SAM (h), IPR (i) et non-IPR (j) inter Col-0 et pCUC2::gai-1-VENUS plantarum. P valores duo test Kolmogorov-Smirnov adhibiti sunt.
Deinde probavimus effectum inhibitionis GA significandi speciatim in IPR. Ad hunc finem usi sumus cotyledon poculi 2 (CUC2) fautoris expressionem dominantis negativi gai-1 interdum fusi ad VENUS (in linea pCUC2::gai-1-VENUS). In typo silvestri SAM, promotor CUC2 expressionem plurimorum IPRs in SAM agit, inclusis cellulis confiniis, a P4 deinceps, et similis expressio specifica in plantis pCUC2::gai-1-VENUS observata est (vide infra). Distributio divisionis cellae angulorum trans SAM vel IPR pCUC2::gai-1-VENUS plantarum non signanter differt ab illa generis silvestris, quamvis inopinate invenimus cellulas sine IPR in his plantis divisas ad altiorem frequentiam 80-90° (Fig. 6f-j).
Propositum est directionem divisionis cellae a geometria SAM dependere, praesertim accentus tensilis a textu curvature46 genitus. Itaque quaesivimus num figura SAM in mutationibus della globali mutant et pCUC2::gai-1-VENUS mutata sit plantae. Ut ante 12 relatum est, magnitudo mutant SAM della globali maior quam generis silvestris (Supplent. Fig. 13a, b, d). In situ hybridizationis CLV3 et STM RNA dilatationem meristem in della mutante confirmarunt et ulteriorem expansionem lateralem caulis cellae ostenderunt (Supplementary Fig. 13e, f, h, i). Sed curvatura SAM in utroque genotypo similis erat (Supplem. Fig. 13k, m, n, p). Similem magnitudinem auctam animadvertimus in gai-t6 rga-i2 rgl1-1 rgl2-1 della quadrupla mutant sine mutatione curvaturae ad genus liaec comparatum (Supplementarium fig. 13c, d, g, j, l, o, p). Frequentia orientationis cellulae divisionis etiam in della quadruplica mutatur affecta, sed minus quam in mutante delia monolithic (Supplem. Fig. 12d-f). Hic effectus dosis, cum defectus effectus in curvatura, ostendit quod residua RGL3 activitas in Della quadruplum mutant limites mutationes in cellula divisionis orientationis amissione DELLA activitatis et mutationes in cellularum lateralium divisionibus respondent mutationes in GA significans actionem potius quam mutationes in SAM geometriae. Ut supra dictum est, promotor CUC2 in SAM incipiendo a P4 expressionem IPR impellit (Fig. 14a, b), et contra, pCUC2::gai-1-VENUS SAM magnitudinem imminutam sed curvaturam superiorem (Supplmentariam Fig. 14c-h). Haec mutatio in morphologia pCUC2::gai-1-VENUS SAM evenire potest in diversa distributione extollionum mechanicarum comparatarum ad genus silvestre, in quo altae circumferentiales passiones breviore intervallo ab SAM centro47 incipiunt. Vel, mutationes in pCUC2::gai-1-VENUS SAM morphologiam provenire possunt ex mutationibus proprietatum mechanicarum regionalium per expressionem transgenm inductarum. In utroque casu, hoc ex parte offset effectus mutationum in GA significans augendo verisimilitudinem cellulas in orientatione circumferential/transversae dividentes, observationes nostras explicans.
Simul sumpta, nostra notitia confirmant altiorem GA significans munus activum agere in plano divisionis cellae lateralis orientationis in IPR. Ostendent etiam meristem curvaturam etiam influere orientationem plani cellae in IPR.
Transversa orientatio divisionis plane in IPR, ob altum GA activitatem significantem, suggerit GA prae-ordinat fasciculum cellularum radialem in epidermide intra SAM ad definiendam organisationem cellularum quae postea in internodio epidermali invenietur. Re quidem vera huiusmodi tabulae cellularum in SAM mutantium globalis imagines saepe visi sunt (fig. 6b). Ita ut ulteriorem functionem evolutionis exemplaris GA signantis in SAM explorare consuevimus, temporis lapsu imaginantes ad disponendum spatialem cellularum in IPR specie (Ler et Col-0), della mutante globali, et pCUC2:: gai-1-VENUS transgenicas plantas.
Invenimus qmRGA demonstrasse GA significans actionem in IPR ab P1/P2 auctam et in P4 luculentam, et hoc exemplum in tempore (Fig. 4a-f et Accessiones Fig. 8c-f, k). Ad cellularum spatialem ordinationem in IPR cum signo augendo resolvendo, cellulas Ler IPR supra et ad latera P4 designavimus secundum fatum evolutionis enucleatum 34 h post primam observationem, hoc est plusquam duo tempora plastica, sinentes nos sequi IPR cellulas in primordium evolutionis a P1/P2 ad P4. Tres colores diversicolores usi sumus: flavis pro cellulis illis quae in primordium prope P4 integrabantur, viridis pro iis qui in IPR erant, et purpura pro utroque processu participando (Fig. 7a-c). Ad t0 (0 h), 1-2 stratae cellularum IPR ante P4 conspectae erant (Fig. 7a). Ut expectati, cum hae cellulae dividerentur, maxime per planum divisionem transversalem fecerunt (Fig. 7a-c). Similes proventus consecuti sunt Col-0 SAM utentes (in P3, cuius plicae limbi P4 in Ler similiter), quamvis in hoc genotypo ovile ad terminum floralem formatum celavit cellulas IPR citius (Fig. 7g-i). Ita divisio cellularum formarum IPR cellularum prae-ordinat in ordines radiales, sicut in internodibus. Constitutio ordinum radialium et localisatio cellularum IPR inter organa successiva suadent has cellulas progenitores internodales esse.
Hic elaboravimus rationemmetricam GA significans biosensorem, qmRGA, quae quantitatis tabularum GA significat actionem, quae ex coniunctionibus GA et GA receptarum coniunctionum, intercursus endogenosis significativis meatus obscuratis, notitias de GA functione in gradu cellularum edocendo edocuit. Ad hunc finem modificatio DELLA interdum, mRGA, facultatem ligandi DELLA sociis commercio amisit, sed ad proteolysin GA inductam sensibilem permanet. qmRGA respondet tam exogenosis quam endogenosis mutationibus in GA gradibus, et eius sensibilium dynamicarum proprietatum aestimationem mutationum spatiotemporalium in GA significans activitatem in evolutione. qmRGA est etiam instrumentum flexibile, quod diversis fibris adaptari potest, mutato promotore adhibito ad suam expressionem (si opus est), et data conservata ratione GA signantis pervium et PFYRE ARGUMENTUM per angiospermum, verisimile est ad alias species22 transferri. Cum hoc consentaneum, aequivalens mutatio oryzae SLR1 DELLA interdum (HYY497AAA) ostensa est, ut incrementum repressoris activitatis SLR1 reprimat, dum paulum tantum degradationi mediatae GA deminutio eius, similis mRGA23, monstrata est. Egregie studia recentia in Arabidopsis demonstraverunt unum amino acidum mutationem in dominio PFYRE (S474L) transcribendam activitatem RGA immutasse, quin suam facultatem tribuendi cum factore transscriptionis sociis50 mutet. Quamvis haec mutatio proxime accedat ad substitutiones 3 amino acidi in mRGA existentes, studia nostra ostendunt has duas mutationes mutatis notis distinctas DELLA. Etsi plerique factores transcriptionis socii obligant ad dominia LHR1 et SAW di DELLA26,51, quaedam amino acida conservata in PFYRE domain adiuvant has interationes stabilire possunt.
Internodus evolutionis notae clavis est architecturae plantae et emendatio cedit. qmRGA altiorem GA significans actionem in IPR cellulas internodio progenitoris revelavit. Coniungendo quantitatis imaginatio et genetica, ostendimus GA signare exemplaria superimponere planis orbicularibus/transversis cellulis in SAM epidermide, formando organisationem divisionis cellulae ad internodium evolutionis requisitam. Plures regulatores divisionis cellularum plani orientationis in progressu 52,53 notati sunt. Nostrum opus evidens exemplum praebet quomodo GA significans activitatem hunc modulum cellulosum moderetur. DELLA secet cum implicationibus interdum complexibus 41 , significans GA dividendo orientationem cellulam planam dirigendo directo influendo corticali microtubulae orientationis 40, 41, 54,55. Improviso demonstravimus in SAM, relato altioris GA activitatem significans non esse cellam elongationem vel divisionem, sed solum incrementum anisotropium, quod consonans cum effectu directo GA in directione divisionis cellae in IPR. Attamen non possumus excludere hunc effectum posse etiam esse indirectum, exempli gratia mediante GA-inducto pariete cellae mollito. Mutationes in muro cellae proprietates accentus mechanicas 57,58 inducunt, quae etiam influere possunt orientationem in plano cellae divisionis afficiendo orientationem microtubule corticalis 39, 46,59. Coniuncti effectus GA inductae accentus mechanicae et directae ordinationes microtubulae per GA involvi possunt in generando peculiarem exemplar divisionis orientationis in IPR ad internodia definienda, et adhuc studiis opus est ad hanc notionem probandam. Similiter studia priora illustraverunt momentum servo DELLA-interactentis servo TCP14 et 15 in potestate formationis internodii 60,61 et hae factores possunt mediare actionem GA una cum BREVIPEDICELLO (BP) et PENNYWISE (PNY), quae evolutionis internodium ordinant et ostensa sunt influentia GA significationis 2,62. Cum DELLAs inter se occurrunt cum acido brassinoteroideo, ethylene, jasmonico, et acido abscisico (ABA) significantes vias 63, 64, et ut hae hormones microtubulae orientationis influere possint, effectus GA in cellulae divisionis orientationis ab aliis hormones etiam mediari possunt.
In primis studiis cytologicis demonstraverunt regiones interiores et exteriores Arabidopsis SAM requiri ad progressionem internodium 2,42. Quod GA actuose divisionem cellularum in fibris 12 interioribus moderatur, duplicem functionem GA sustinet in meristem et internodio in SAM moderando. Exemplar divisionis cellulae directionalis etiam in SAM textu interiore arcte regulatur, et haec ordinatio essentialis est pro incremento caulis 52 . Multum interest examinare utrum GA etiam munus agere in plano cellae divisionis in interiore SAM organizatione dirigatur, eo quod specificationem et progressionem internodium intra SAM synchronum habeat.
Plantae in vitro in solo creverunt vel 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) suppletum cum 1% sucroso et 1% agar (Sigma) sub norma conditionis (16 h lucis, 22 °C), exceptis experimentis hypocotylis et radicis incrementi in quibus semina in catillis verticalibus sub constanti luce et 22°C creverunt. Ad experimenta nitrata, plantae in medio MS medio mutatae ( plantae mediae bioWORLD ) aptae nitrate suppletae (0 vel 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinatae, 1% sucrosae et 1% A-agar (Sigma) sub conditionibus longis.
GID1a cDNA in pDONR221 inserta erat cum pDONR P4-P1R-pUBQ10 et pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW ad generandum pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA insertum pDONR221 in pB7RWG266 repositum est ad generandum p35S:IDD2-RFP. Ad generandum pGID1b::2xmTQ2-GID1b, a 3.9 kb fragmentum fluminis GID1b codingis regionis et 4.7 kb fragmentum continens GID1b cDNA (1.3 kb) ac terminatorium (3.4 kb) primum auctis utentibus primariis in Tabula supplementaria 3 ac deinde insertis pDONR P4-P1R (ThermoR P4-P1R) et pDONR P4-P1R (ThermoR-P1R) inserta pDONR P4-P1R Piscator Scientific), respective, et tandem cum pDONR221 2xmTQ268 in pGreen 012567 vectoris clypeum portae exquisitae utens. Ad generandum pCUC2::LSSmOrange, promotor CUC2 sequentium (3229 bp flumine ATG) sequitur coding series magnarum Stokes-aversae mOrange (LSSmOrange)69 cum signo localizationis nuclei N7 et terminator NOS transcriptionalis in pGreen kanamycin-fragmentum 3fragmentum utens Gate. Planta binarii vectoris in Agrobacterium tumefaciens cola GV3101 introducta et in folia Nicotiana benthamiana per Agrobacterium methodo infiltrationi et in arabidopsis thaliana Col-0 methodo florali tingi, respectively introducta est. pUBQ10 ::qmRGA pUBQ10 ::GID1a-mCherry et pCLV3 ::mCherry-NLS qmRGA ab F3 et F1 progenies cruces respectivae separatim aberant.
RNA in situ hybridizationis fiebat circa 1 cm longi palmi apicibus72, quae collectae sunt et statim in solutione FAA fixae (3.7% formaldehyde, acidum aceticum 5%, ethanol% 50) prae refrigeratum ad 4 °C. Post 2 15 min vacuum curationes, fixativae mutatae sunt et exemplaria pernoctare incubata sunt. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, et RGL3 cDNAs et antisense scrutantur 3′-UTRs utentes primariis in Tabula Supplementaria exhibitae 3 as, uti a Rosier et al.73 descripti sunt. Digoxigenin-intitulatum probe immuno detectum utens digoxigenin elementorum (divolutionem 3000-plicarum; Roche, catalogus numerus: 11 093 274 910), et sectiones 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatae (BCIP, 250-folii) dilutionis nitrobluae (NBT, 200-trizolii) maculatae sunt.
Post tempus: Feb-10-2025