Nematoda pinorum est endoparasitus migratorius quarantenae, qui notus est graves iacturas oeconomicas in oecosystematibus silvarum pinearum causare. Hoc studium actionem nematicidam indolorum halogenatorum contra nematodas pinorum et mechanismum actionis eorum perlustrat. Actiones nematicidae 5-iodoindoli et avermectini (controlis positivi) contra nematodas pinorum similes et altae erant in concentrationibus parvis (10 μg/mL). 5-iodoindolum fecunditatem, actionem reproductivam, mortalitatem embryonalem et larvalem, et mores locomotores minuit. Interactiones moleculares ligandorum cum receptoribus canalium chloridi glutamati-receptarum invertebratis specificis notionem confirmant 5-iodoindolum, sicut avermectinum, arcte ad locum activum receptoris ligare. 5-iodoindolum etiam varias deformationes phenotypicas in nematodis induxit, inter quas collapsum/contractionem organorum abnormalem et vacuolizationem auctam. Haec eventa suggerunt vacuolas partes agere posse in morte methylatione nematodorum mediata. Magni momenti est quod 5-iodoindolum ambabus speciebus plantarum (brassicae et raphani) non toxicum erat. Itaque hoc studium demonstrat applicationem iodoindoli sub condicionibus ambientalibus damnum marcescentiae pini moderari posse.
Nematoda pinei (Bursaphelenchus xylophilus) ad nematodas pinei pertinet (PWN), nematodas endoparasiticas migratorias quae notae sunt ob gravem damnum oecologicum oecosystematibus silvarum pinearum inferendum. Morbus marcitiae pinei (PWD), a nematoda pinei causatus, grave problema fit in pluribus continentibus, inter quas Asia et Europa, et in America Septentrionali, nematoda species pinei introductas destruit. Declinatio pinei magnum problema oeconomicum est, et spes diffusionis eius globalis sollicitat. Hae species pinei maxime a nematoda infestantur: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, et Pinus radiata. Nematoda pinei gravis morbus est qui pinas intra hebdomades vel menses ab infectione necare potest. Praeterea, eruptiones nematodarum pinei communes sunt in variis oecosystematibus, ita catenae infectionis persistentes constitutae sunt.
*Bursaphelenchus xylophilus* est nematoda plantarum parasitica quarantenae, ad superfamiliam *Aphelenchoidea* et cladem 102.5 pertinens. Nematoda haec fungis vescitur et in textibus ligneis pinorum reproducitur, in quattuor stadia larvalia diversa evolvens: L1, L2, L3, L4 et individuum adultum1,6. Sub condicionibus inopiae cibi, nematoda pinorum in stadium larvale specializatum – *dauer* – transit, qui vectorem suum – *Monochamum alternatum* – parasitizat et ad pinos sanos transfertur. In hospitibus sanis, nematoda celeriter per texta plantarum migrant et cellulis parenchymatosis vescuntur, quod ad plures reactiones hypersensitivitatis, marcescentiam pinorum et mortem intra annum post infectionem1,7,8 ducit.
Biologica coercitio nematodum pini diu difficilis fuit, cum mensuris quarantenae iam ab saeculo XX pertinentibus. Strategiae hodiernae ad nematoda pini coercenda imprimis curationes chemicas includunt, inter quas fumigationem ligni et implantationem nematicidarum in truncos arborum. Nematicida frequentissime adhibita sunt avermectinum et avermectini benzoas, quae ad familiam avermectinorum pertinent. Hae chemicae pretiosae contra multas species nematodarum valde efficaces sunt et tuta pro ambitu habentur9. Tamen, usus repetitus horum nematicidarum pressionem selectionis creare expectatur quae fere certe ad emergentiam nematodarum pini resistentium ducet, ut demonstratum est pro pluribus pestibus insectorum, ut Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella et nematodis Trichostrongylus colubriformis et Ostertagia circumcincta, quae gradatim resistentiam ad avermectinas evolverunt10,11,12. Quapropter, exemplaria resistentiae regulariter investiganda sunt et nematicida continue examinanda ut mensurae alternativae, sumptibus efficaces et amicae pro ambitu ad PVD coercendum inveniantur. Recentibus decenniis, nonnulli auctores usum extractarum plantarum, oleorum essentialium et volatilium ut agentes ad nematoda coercenda proposuerunt13,14,15,16.
Nuper actionem nematicidam indoli, moleculae signalationis intercellularis et interregna, in *Caenorhabditis elegans* demonstravimus [17]. Indolum est signum intracellulare late diffusum in oecologia microbica, numerosas functiones moderans quae physiologiam microbialem, formationem sporarum, stabilitatem plasmidis, resistentiam medicamentorum, formationem biopelliculae, et virulentiam [18, 19] afficiunt. Actio indoli et derivatorum eius contra alia nematoda pathogena non investigata est. In hoc studio, actionem nematicidam 34 indolorum contra nematoda pini investigavimus et mechanismum actionis potentissimi 5-iodoindoli per microscopiam, photographiam temporis intervalli, et experimenta molecularis docking elucidavimus, et effectus eius toxicos in plantis per experimentum germinationis seminum aestimavimus.
Altae concentrationes indoli (>1.0 mM) antea relatae sunt effectum nematicidum in nematoda habere17. Post curationem B. xylophili (stadiis vitae mixtis) indolo vel 33 diversis derivatis indoli ad 1 mM, mortalitas B. xylophili mensurata est numerando nematodas vivas et mortuas in gregibus testigo et tractato. Quinque indola significantem actionem nematicidam exhibuerunt; superviventia gregis testigo non tractati 95 ± 7% erat post 24 horas. Ex 34 indolis probatis, 5-iodoindolum et 4-fluoroindolum ad 1 mM mortalitatem 100% causaverunt, dum 5,6-difluoroindigo, methylindolum-7-carboxylatum, et 7-iodoindolum mortalitatem circiter 50% causaverunt (Tabula 1).
Effectus 5-iodoindoli in formationem vacuolorum et metabolismum nematodis ligni pini. (A) Effectus avermectini et 5-iodoindoli in nematoda mascula adulta, (B) ova nematodum stadii L1 et (C) metabolismum B. xylophili, (i) vacuolae non observatae sunt post 0 horas, curatio effecit (ii) vacuolas, (iii) accumulationem vacuolorum multiplicium, (iv) tumorem vacuolorum, (v) fusionem vacuolorum et (vi) formationem vacuolorum gigantum. Sagittae rubrae tumorem vacuolorum indicant, sagittae caeruleae fusionem vacuolorum et sagittae nigrae vacuolas giganteas indicant. Scala = 50 μm.
Praeterea, hoc studium etiam processum sequentialem mortis methano-inductae in nematodis pini descripsit (Figura 4C). Mors methanogenica est genus mortis cellularis non-apoptoticum cum accumulatione vacuolorum cytoplasmaticorum prominentium coniunctum. Vitia morphologica in nematodis pini observata videntur arcte coniuncta esse cum mechanismo mortis methano-inductae. Examen microscopicum variis temporibus ostendit vacuolas giganteas formatas esse post 20 horas expositionis ad 5-iodoindolum (0.1 mM). Vacuolae microscopicae observatae sunt post 8 horas curationis, et numerus earum auctus est post 12 horas. Plura vacuolae magnae observatae sunt post 14 horas. Plura vacuolae fusae clare visibiles erant post 12-16 horas curationis, indicantes fusionem vacuolorum esse basin mechanismi mortis methanogenicae. Post 20 horas, plura vacuolae giganteae per totum vermem inventae sunt. Hae observationes primum nuntium de metuosis in C. elegans repraesentant.
In vermibus 5-iodoindolo tractatis, aggregatio et ruptura vacuolorum etiam observatae sunt (Fig. 5), ut flexura vermium et emissio vacuolorum in ambitum demonstratur. Disruptio vacuolorum etiam in membrana testae ovi observata est, quae normaliter ab L2 per exclusionem integra conservatur (Fig. Supplementaria S2). Hae observationes implicationem accumulationis fluidorum et defectus osmoregulationis, necnon laesionis cellularis reversibilis (RCI), in processu formationis et suppurationis vacuolorum confirmant (Fig. 5).
Munus iodi in formatione vacuolorum observata hypothetice constituentes, actionem nematicidam iodidi natrii (NaI) et iodidi kalii (KI) investigavimus. Attamen, in concentrationibus (0.1, 0.5 vel 1 mM), neque superviventiam nematodorum neque formationem vacuolorum affecerunt (Figura Suppletoria S5), quamquam 1 mM KI effectum nematicidam levem habuit. Contra, 7-iodoindolum (1 vel 2 mM), sicut 5-iodoindolum, vacuolas multiplices et deformationes structurales induxit (Figura Suppletoria S6). Duo iodoindola similes notas phenotypicas in nematodis pinorum ostenderunt, cum NaI et KI non ostenderent. Curiose, indolum formationem vacuolorum in *B. xylophilus* in concentrationibus probatis non induxit (data non exhibita). Ita, eventus confirmaverunt complexum indoli-iodi vacuolizationem et metabolismum *B. xylophili* responsabilem esse.
Inter indola ad actionem nematicidam examinata, 5-iodoindolum indicem lapsus altissimum -5.89 kcal/mol habuit, deinde 7-iodoindolum (-4.48 kcal/mol), 4-fluoroindolum (-4.33), et indolum (-4.03) (Figura 6). Fortis nexus hydrogenii in spina principali 5-iodoindoli cum leucino 218 nexum eius stabilizat, dum omnia alia derivata indoli cum serina 260 per nexus hydrogenii catenae lateralis ligant. Inter alia iodoindola simulata, 2-iodoindolum valorem ligationis -5.248 kcal/mol habet, quod propter principalem vinculum hydrogenii cum leucina 218 est. Aliae ligationes notae includunt 3-iodoindolum (-4.3 kcal/mol), 4-iodoindolum (-4.0 kcal/mol), et 6-fluoroindolum (-2.6 kcal/mol) (Figura Supplementaria S8). Pleraque indola halogenata et ipsum indolum, exceptis 5-iodoindolo et 2-iodoindolo, nexum cum serina 260 formant. Quod nexus hydrogenii cum leucina 218 efficacis nexus receptoris-ligandi indicat, ut observatum est pro ivermectino (Figura Suppletoria S7), confirmat 5-iodoindolum et 2-iodoindolum, sicut ivermectinum, arcte ad locum activum receptoris GluCL per leucinam 218 ligare (Figura 6 et Figura Suppletoria S8). Proponimus hunc nexum requiri ad structuram pororum apertorum complexus GluCL conservandam et, arcte ad locum activum receptoris GluCL ligando, 5-iodoindolum, 2-iodoindolum, avermectinum et ivermectinum sic canalem ionicum apertum conservare et absorptionem fluidi permittere.
Nexus molecularis indoli et indoli halogenati ad GluCL. Orientationes ligaminum (A) indoli, (B) 4-fluoroindoli, (C) 7-iodoindoli, et (D) 5-iodoindoli ad locum activum GluCL. Proteinum taenia repraesentatur, et vincula hydrogenii principalia lineis flavis punctatis monstrantur. (A′), (B′), (C′), et (D′) interactiones ligandorum correspondentium cum residuis aminoacidorum circumstantibus ostendunt, et vincula hydrogenii catenae lateralis sagittis roseis punctatis indicantur.
Experimenta peracta sunt ad effectum toxicum 5-iodoindoli in germinationem seminum brassicae et raphani aestimandum. 5-iodoindolum (0.05 vel 0.1 mM) vel avermectinum (10 μg/mL) effectum parvum vel nullum in germinationem initialem et emergentiam plantularum habuerunt (Figura 7). Praeterea, nulla differentia significativa inventa est inter germinationis ratem testium non tractatorum et seminum 5-iodoindolo vel avermectino tractatorum. Effectus in elongationem radicis pivotantis et numerum radicum lateralium formatarum insignis erat, quamquam 1 mM (decies concentrationem activam) 5-iodoindoli evolutionem radicum lateralium leviter retardavit. Haec eventa indicant 5-iodoindolum non toxicum esse cellulis plantarum nec processus evolutionis plantarum in concentrationibus studiatis impedire.
Effectus 5-iodoindoli in germinationem seminum. Germinatio, germinatio et radicatio lateralis seminum *B. oleraceae* et *R. raphanistri* in medio agariano Murashige et Skoog cum vel sine avermectino vel 5-iodoindolo. Germinatio post tres dies incubationis ad 22°C observata est.
Hoc studium aliquot casus nematodum ab indolis necandi refert. Magni momenti est quod haec prima relatio est de iodoindolo methylatione inducente (processu causato ab accumulatione vacuolarum parvarum quae paulatim in vacuolas gigantes coalescunt, tandem ad rupturam membranae et mortem ducunt) in acubus pini, cum iodoindolo proprietates nematicidas significantes exhibente, similes illis nematicidae commercialis avermectini.
Indola antea relata sunt multiplices functiones signalationis in prokaryotis et eukaryotis exercere, inter quas inhibitio/formatio biopelliculae, superviventia bacterialis, et pathogenicitas19,32,33,34. Nuper, effectus therapeutici potentiales indolorum halogenatorum, alcaloidum indoli, et derivatorum indoli semisyntheticorum amplum studium investigationis attraxerunt35,36,37. Exempli gratia, indola halogenata demonstrata sunt cellulas persistentes Escherichia coli et Staphylococcus aureus necare37. Praeterea, interest scientificum efficaciam indolorum halogenatorum contra alias species, genera, et regna studere, et hoc studium est gradus ad hunc finem assequendum.
Hic, mechanismum letalitatis in *C. elegans* a 5-iodoindolo inductae proponimus, qui in laesione cellulari reversibili (RCI) et methylatione fundatur (Figurae 4C et 5). Mutationes oedematosae, ut tumor et degeneratio vacuolaris, indices RCI et methylationis sunt, quae ut vacuolae ingentes in cytoplasmate manifestantur [48,49]. RCI productionem energiae impedit productionem ATP reducendo, defectum antliae ATPase causando, vel membranas cellulares perturbando et influxum rapidum Na+, Ca2+, et aquae causando [50,51,52]. Vacuolae intracytoplasmaticae in cellulis animalibus oriuntur ex accumulatione fluidi in cytoplasmate propter influxum Ca2+ et aquae [53]. Curiose, hic mechanismus laesionis cellularum reversibilis est si damnum temporarium est et cellulae ATP producere incipiunt per certum tempus, sed si damnum perseverat vel peior fit, cellulae moriuntur.54 Nostrae observationes ostendunt nematoda 5-iodoindolo tractata biosynthesis normalis restituere non posse post expositionem ad condiciones stressorias.
Phenotypus methylationis a 5-iodoindolo in B. xylophilo inductus fortasse ex praesentia iodi et distributione eius moleculari oritur, cum 7-iodoindolum minus effectum inhibitorium in B. xylophilo quam 5-iodoindolum habuerit (Tabula 1 et Figura Suppletoria S6). Haec eventa partim congruunt cum studiis Maltese et al. (2014), qui rettulerunt translocationem partis nitrogenii pyridyl in indolo a positione para- ad meta- vacuolizationem, inhibitionem crescentiae, et cytotoxicitatem in cellulis U251 abolivisse, suggerens interactionem moleculae cum loco activo specifico in proteino esse criticam27,44,45. Interactiones inter indolum vel indola halogenata et receptores GluCL in hoc studio observatae etiam hanc notionem confirmant, cum 5- et 2-iodoindolum inventum sit receptoribus GluCL fortius ligare quam alia indola examinata (Figura 6 et Figura Suppletoria S8). Iodum in secunda vel quinta positione indoli leucino 218 receptoris GluCL per vincula hydrogenii principalia ligare inventum est, dum alia indola halogenata et ipsum indolum vincula hydrogenii catenae lateralis debilia cum serina 260 formant (Figura 6). Ideo coniecimus localizationem halogeni munus magnum in inductione degenerationis vacuolaris agere, dum nexus firmus 5-iodoindoli canalis ionicus apertus tenet, ita influxum fluidi rapidum et rupturam vacuoli permittens. Tamen, mechanismus actionis 5-iodoindoli accuratus determinandus manet.
Ante usum practicum 5-iodoindoli, effectus eius toxicus in plantas investigandus est. Nostra experimenta germinationis seminum demonstraverunt 5-iodoindolum nullum effectum negativum in germinationem seminum aut subsequentes processus evolutionis in concentrationibus studiatis habuisse (Figura 7). Ergo, hoc studium fundamentum praebet ad usum 5-iodoindoli in ambitu oecologico ad noxiam nematodum pinorum pinis coercendam.
Relationes priores demonstraverunt therapiam indolo fundatam potentialem aditum praebere ad problema resistentiae antibioticorum et progressionis cancri solvendum. Praeterea, indola actiones antibacteriales, anticancerosas, antioxidantes, antiinflammatorias, antidiabeticas, antivirales, antiproliferativas et antituberculosas habent et basim pro evolutione medicamentorum promittere possunt. Hoc studium primum usum potentialem iodi ut medicamenti antiparasitarii et anthelmintici suggerit.
Avermectinum ante triginta annos inventum est et Praemium Nobelianum anno 2015 accepit, et usus eius ut anthelminticum adhuc active pergit. Attamen, propter rapidum incrementum resistentiae ad avermectina in nematodis et pestibus insectorum, strategia alternativa, vilis pretii et amica ambienti necessaria est ad infectionem PWN in pinis moderandam. Hoc studium etiam mechanismum refert quo 5-iodoindolum nematoda pinorum necat et 5-iodoindolum toxicitatem humilem cellulis plantarum habere, quod bonas prospectus pro futuro usu commerciali aperit.
Omnia experimenta a Commissione Ethica Universitatis Yeungnam, Gyeongsan, Corea, probata sunt, et methodi secundum normas Commissionis Ethicae Universitatis Yeungnam peractae sunt.
Experimenta incubationis ovorum secundum rationes iam constitutas43 peracta sunt. Ad aestimandas rationes exclusionis (HR), nematoda adulta unius diei (fere 100 feminae et 100 mares) in patellas Petri fungum continentes translata sunt et per 24 horas crescere permissa sunt. Ova deinde isolata et 5-iodoindolo (0.05 mM et 0.1 mM) vel avermectino (10 μg/ml) ut suspensione in aqua sterili distillata tractata sunt. Hae suspensiones (500 μl; circiter 100 ova) in puteos laminae culturae textuum 24 puteorum translatae et ad 22°C incubatae sunt. Numeratio L2 post 24 horas incubationis facta est, sed mortua existimata est si cellulae non moverentur cum filo platineo tenui stimularentur. Hoc experimentum duobus gradibus peractum est, utroque cum sex repetitionibus. Data ex utroque experimento coniuncta et exhibita sunt. Percentatio HR sic computatur:
Mortalitas larvalis per methodos antea elaboratas aestimata est. Ova nematodum collecta sunt et embryones per exclusionem in aqua sterili distillata synchronizati sunt ad larvas stadii L2 generandas. Larvae synchronizatae (circiter 500 nematoda) cum 5-iodoindolo (0.05 mM et 0.1 mM) vel avermectino (10 μg/ml) tractatae et in laminis Petri *B. cinereae* alutae sunt. Post 48 horas incubationis ad 22°C, nematoda in aqua sterili distillata collecta et ad praesentiam stadiorum L2, L3, et L4 examinata sunt. Praesentia stadiorum L3 et L4 transformationem larvalim indicavit, dum praesentia stadii L2 nullam transformationem indicavit. Imagines acquisitae sunt per Systema Digitale Imaginum Cellularum iRiS™. Hoc experimentum in duobus stadiis peractum est, utroque cum sex repetitionibus. Data ex utroque experimento coniuncta et exhibita sunt.
Noxietas 5-iodoindoli et avermectini in semina aestimata est per experimenta germinationis in laminis agaro Murashige et Skoog. Semina *B. oleracea* et *R. raphanistrum* primum in aqua destillata sterili per unum diem macerata sunt, deinde cum 1 ml ethanoli 100% lavata, cum 1 ml lixiviae commercialis 50% (3% hypochloriti natrii) per 15 minuta sterilizata, et quinquies cum 1 ml aquae sterilis lavata. Semina sterilizata deinde in laminas agaro germinationis pressa sunt, continentes 0.86 g/l (0.2X) medii Murashige et Skoog et 0.7% agaro bacteriologico cum vel sine 5-iodoindolo vel avermectino. Laminae deinde ad 22°C incubatae sunt, et imagines post 3 dies incubationis captae sunt. Hoc experimentum duobus gradibus peractum est, quorum unumquodque sex repetitiones habebat.
Tempus publicationis: XXVI Februarii, MMXXXV