Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versio navigandi quam uteris habet subsidium CSS limitatum.Ad optimos eventus commendamus ut recentiore versione navigatoris utaris (vel inactivare Modus Compatibilitas in Penitus Rimor).Interim ut sustentationem permanentem ostendamus situm sine stylo vel JavaScript.
Inventio et utilior usus productorum naturalium adiuvari possunt ad meliorem vitam humanam pertinentes.Planta incrementa inhibitoriae chemicae late adhibentur sicut herbicides ad zizania moderanda.Propter necessitatem utendi diversis herbicidis generibus, opus est compositiones cognoscere cum novis agendi mechanismis.In hoc studio novum N -alkoxypyrrole compositum, coumamonamide, e Streptomyces werraensis MK493-CF1 indagavimus, et integram synthesim processum constituimus.Per actionem biologicam pertentat, invenimus acidum ur-monoamicum medium syntheticum urs-monoamide et potentiale esse.plant incrementum inhibitor.Praeterea variae derivationes acidorum urbenonicorum, incluso urbenyloxy derivativae (UDA), elaboraverunt, quae actionem herbicidalem altam habet sine negatione ad incrementum HeLa cellularum afficientium.Etiam derivationes acidorum urmoticorum invenimus microtubulas plantas perturbare;praeterea KAND afficit filamenta actin et mortem inducit cellam;Hi effectus multifaceti differunt ab inhibitoribus notarum microtubuli et novam mechanismum actionis pro acido ursonico, quod magnum commodum est in evolutione novarum herbicidum repraesentat.
Inventio et practica applicatio fructuum naturalium eorumque derivatorum medium est ad augendam qualitatem vitae humanae.Secundae metabolitae a microorganismis, plantis et insectis productae ad maiores progressus in medicina et agricultura perduxerunt.Multa antibiotica et anti-leukemia medicamenta ex productis naturalibus ortae sunt.Praeterea, variae speciespesticidesfungicides et herbicides ex his nativis ad usum agriculturae decerpuntur.Speciatim viriditas temperantiae herbicides magni momenti sunt instrumenta ad fruges augendas in hodiernis agri cultura praebendis, et variae compositionum rationes iam ad commercium adhibitae sunt.Plures processus cellulosi in plantis, ut photoynthesis, amino metabolismi acidi, synthesis parietis cellae, mitosis moderatio, phytohormonum significans vel synthesis interdum, scuta herbicidis typica considerantur.Composita, quae munus microtubule inhibent, herbicidum genus commune est, quod incrementum plantae afficit, ordinationem mitoticam afficiens.
Microtubulae componentes cytoskeleton sunt et in cellulis eukaryoticis late conservantur.Tubulinus heterodimerus constat ex tubulino et β-tubulino microtubulam linearem formantibus protofilamentis cum 13 protofilamentis structuram cylindricam formantibus.Microtubulae multiplices partes agunt in cellulis plantis, inclusa figura cellularum, divisione cellae determinantis, et onerariae intracellulares 3,4.Cellulae plantae microtubulae sub interphasi plasmatis membranae continentes, et hae microtubulae corticales sic dictae per microfibrils cellulosos ordinandas per complexiones cellulosae synthaseos ordinandas putantur.Microtubulae corticales cellularum radicum epidermalium, quae in zona celeri elongationis radicis apice positae sunt, lateraliter sita sunt, et microfibrae cellulosae has microtubulas sequuntur et directionem dilatationis cellulae limitant, per quod elongationem cellae anisotropicae promovent.Ergo munus microtubule ad morphologiam plantandam propinqua est.Amino acid substitutiones in genes descriptam tubulin causa skew corticalis microtubulae vestit et sinistrum vel dextrum incrementum in Arabidopsis 6,7.Similiter mutationes in microtubule-consociatis dynamicis quae microtubule moderantes etiam ad radicem pravam incrementum8,9,10,11,12,13 ducere possunt.Accedit, curatio cum herbicidis microtubule-disontistis ut disopyramide, etiam pretilachlor noto, etiam obliquae radicis sinistrae incrementum 14 causat.Haec notitia indicant accuratam ordinationem microtubuli functionis criticam esse ad directionem vegetationis incrementi determinandam.
Variae species microtubulae inhibitores repertae sunt, et haec medicamenta ad inquisitionem cytoskeletalem, sicut et ad agriculturam et medicinam, significantes contributiones fecerunt.Speciatim, oryzalin, composita dinitroanilina, composita disopyramida, benzamide-relata, eorumque analoga munus microtubuli inhibere possunt et per hoc incrementum plantae inhibere.Ideo herbicides late dicuntur.Cum tamen microtubulae magnae componentis plantarum et cellularum animalium, maxime microtubulae inhibitores cytotoxici ad utrumque genus cellularum sunt.Ideo, non obstante utilitate cognita sicut herbicides, paucitas agentium antimicrotubulae ad usum practicum adhibentur.
Streptomyces genus est familiae Streptomyces, quae bacteria aerobica, gram-positiva, filamentosa comprehendit, et pervulgatum est facultatem ad amplis metabolitis secundariis producendi.Ideo consideratur unus ex praecipuis fontibus novorum productorum naturalium biologice activorum.In studio currenti novam compositionem compositam nomine coumamonamide repertam, quae a Streptomyces werraensis MK493-CF1 et S. werraensis ISP 5486. Reperiebamus, analysin spectralem ac plenam analysim spectralem, structura coumamonamide insignita erat et singulare sceleti N-alkoxypyrroli definitum est.summam.Acidum ursmonicum, medium syntheticum de ursmonoamide eiusque derivatis, inventum est ad prohibendum incrementum et germinationem popularis exemplaris plantae Arabidopsis thalianae.In studiorum structura-activo habitudine invenimus compositum cum C9 acido ursonico mutato, nonyloxy derivativum acidi ursonici (KAND), significanter auget effectum inhibitorium incrementi et germinationis.Egregie inhibitor incrementi plantae nuper inventae incrementum tobacco et hepatis et hepatis cytotoxicum ad bacteria vel HeLa cellulas non fuit.Praeterea nonnullae derivationes acidorum urmotonicorum inducunt phaenotypum pravam radicem, quasi derivationes hae microtubulae directe vel indirecte afficiunt.Cum hac idea consentaneum, observationes microtubularum vel immunohistochemice vel cum servo fluorescentibus insculptis indicant KAND tractationem microtubulae depolymerizes.Praeterea, curatio cum derivationibus acidis kumamotonicis actin microfilamentis disruptis.Ita novam plantam incrementi inhibitoris repperimus cuius unica mechanismus actionis cytoskeleton interitum implicat.
Cola MK493-CF1 a solo in Shinagawa-ku Tokyo separata est.Cola MK493-CF1 mycelium stromalem bene ramosum formatum.Sequentia partialis 16S ribosomalis RNA gene (1422 bp) definita est.Haec cola simillima est S. werraensi (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: cantilena typica, 99,93%).Ex hoc evento statutum est ut hic cola typum S. werraensis intime afficeret.Hanc itaque contentionem praescripto nominavimus S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T eadem mixta bioactiva producit.Cum investigatio prima parum esset in obtinendis rebus naturalibus ex hoc microorganismo, ulterior investigatio chemica elaborata est.Post culturam S. werraensis MK493-CF1 in medio hordei a fermento solido ad 30°C per 14 dies, medium extractum est cum L% EtOH.60 ml sample exsiccata ad 59.5 mg extracti rudis obtinendum erat.Rudis extractum in HPC e converso periodo HPLC subiecta est ut carboxamide N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide nominata (1, coumamonamide nominata, 36.0 mg).Summa copia 1 circiter 60% extracti crudi est.Ideo proprietatibus kumamotoamide I studere in speciali decrevimus.
Coumamonamide 1 pulveris amorphoi coloris albi et massae spectrometriae altae solutionis (HRESIMS) confirmat C6H8N2O2 (fig. 1).PYRROLI C2 substituto fragmenti huius compositi δH 6.94 notatur (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in 1H spectro NMR: 4.5 Hz. , H-5) & δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), & spectrum 13C NMR ostendit praesentiam quatuor atomorum sp2 carbonis.Praesentia coetus inter positio C2 aestimata est ab HMBC correlatione a protono C-3 ad carbonyl amidum carbonis δC 161.1.Praeterea 1 H et 13 C vertices NMR ad δH 4.10 (3H, S) et δC 68.3 indicant praesentiam N-methoxyi in moleculo.Quamvis recta positio methoxyi coetus nondum per analysis spectroscopica adhibita determinata sit, qualis aucta differentia spectroscopiae et abbreviationis nuclei Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide primus compositorum candidatus factus est.
Ad rectam structuram 1 definiendam, summa synthesis fiebat (fig. 2a).Curatio commercii praesto 2-aminopyridinis 2 cum m-CPBA consecuta est in oxydatum 3 respondente 3 quantitatis cede.Post aminoazidationem 2-II, reactionem cyclocondensationis ab Abramovich descriptam in benzene ad 90°C peractam est, ut optatum 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrili 5 in P. obtineret.Celeritate 60% (duo gradus).15,16.Methylationem et hydrolysin 4 tunc dederunt 1-methoxy-1H-pyrrole-2-acidi carboxylici (quod "acidum cumotonicum" 6 vocant, in bono cede (70% duo gradus).Tandem, amidation per acidi chloridi intermedii 6 utens ammoniaci aquei Kumamoto amido 1 in 98% poma dedit.Omnes datae spectralis synthesistae 1 similes semotus 1 erant, ita structura 1 definita est;
Synthesis generalis et analysis biologicae activitatis urbisnamidei et acidi urbenici.(a) Total synthesis of Kumamoto amide.(b) Septem-dierum species silvestres Arabidopsis Columbiae (Col) plantationes in Murashige et Skoog (MS) elatae sunt continens coumamonamideum 6 vel coumamonamideum 1 ad concentrationes indicatas.Squamae bar = 1 cm.
Primum, operas biologicas urbisnamide et eius media aestimata pro viribus incrementi plantae modulandi.Adiecimus varias concentrationes ursmonamidis 1 vel ursmonicarum acidorum 6 ad MS agar medium et excultum Arabidopsis thaliana semina in hoc medio.Hi pertentationes demonstraverunt concentrationes altos (500 μM) 6 radicis incrementum inhibitum (fig. 2b).Deinde varia derivata generavimus, positione 6 6 substituendo et structuram activitatem relationis in illis studiis (analogus processus synthesis in Informationis Supportantibus describitur (SI)).Seminibus Arabidopsis crevit in medium, quo 50 µM derivata acidum ursonicum continet, et radix longitudo mensurata est.ut ex icone ostensum est.Sicut patet in figuris 3a, b, S1, acida coumamo varias longitudines habent catenis alkoxy linearibus (9, 10, 11, 12 et 13) vel catenis alkoxy magnis (15, 16, et 17) in positione N1 habent.Derivationes significans inhibitionis radicis incrementum demonstraverunt.Praeterea invenimus applicationem 200 μM 10, 11 vel 17 germinationi obstare (fig. 3 c et S2).
Studium structurae-activitatis relationis Kumamoto amide et actis componit.a) Structura et synthesis schema analogorum.b) Quantitas radicis longitudinis 7 annorum plantarum in medio MS creverunt cum derivatis vel sine 50 µM coumamonamide.Asterisci significant differentias cum simulata curatione (t test, p< 0.05).n>18. Data monstrantur ut medium ± SD.nt significat "non probatum" quia plus quam L% de seminibus non germinant.c) Quantitas germinationis rate tractatorum seminum incubatis per 7 dies in MS medio cum vel sine 200 µM coumamonamide et mixtis affinibus.Asterisci significant differentias cum curatione ludicra (chi-quadrata test).n=96.
Interestingly, addita alkyl enotatum longioris quam C9 activitatem inhibitoriam redegit, suggerens compositiones acidi kumamotoici relatas postulare enotatum certae quantitatis ad exhibendam eorum biologicam actionem.
Quoniam analysis structura-activitatis relatio demonstravit C9 mutatam esse ad acidum ursonicum et nonyloxy derivativum acidi ursonici (post KAND 11), efficacissimum plantae incrementum inhibitoris fuit, accuratiorem characterem KAND 11. Curatio Arabidopsis eduximus. cum 50 µM KAND 11 germinatio fere omnino impedita est, cum concentrationes inferiores (40, 30, 20, vel 10 μM) KAND 11 incrementum radicis inhibuit in modo dose-dependens (fig. 4a, b).Ad probandum num KAND 11 radicem meristem viability afficit, meristems radicem iodidi propidii maculatam examinavimus et meristem areae magnitudine metivimus.Magnitudo seminum meristis crevit in medio continens 25 μM KAND-11 erat 151.1 ± 32.5 µm, dum magnitudo meristis sationis in medio continente DMSO crevit erat 264.7 ± 30.8 µm (Fig. 4c, d). quod indicat KAND-11 cellulosam actionem restaurat.patentia.Radix meristem.Huic consentaneum est, KAND 11 curatio redacta quantitatem divisionis cellae CDKB2, 1p::CDKB2, 1-GUS signo in radice meristem (Fig. 4e) 17 .Hi eventus indicant KAND 11 incrementum radicis vetare reducendo actionem multiplicationis cellulae.
Analysis inhibitoriae effectus acidi urbenonici derivatorum (derivatorum urbanorum) in incremento.(a) 7 annorum agrestium typus Col plantationes in MS lamellis natae cum concentratione KAND indicatis 11. Scala talea = 1 cm.b) quantitatis radicis longitudinis.Litterae significant differentias significantes (Tukey HSD test, p< 0.05).n>16. Data monstrantur ut medium ± SD.(c) Microscopia confocal propidii iodide-maculati generis silvestris Col radices in lamellis MS maioribus cum vel sine 25 µM KAND 11. brackets albae radicem meristem indicant.Scala bar = 100 µm.d) Quantitas radicis meristem magnitudine (n = 10 ad 11).Statistical differences t-test were determined using (p*< 0.05).Claustra medium mestemae magnitudinis significant.differentialis interventus contra microscopia radicis meristem continens CDKB2 constructum;1pro: CDKB2;1-GUS maculata et maculata in 5-veteris plantationibus in laminas MS cum vel sine 25 µM KAND incavata crevit.
Phytotoxicitas KAND 11 adhuc probata est utens alia planta dicotyledono, tobacco ( tabacum Nicotiana ) , et maioris terrae plantae exemplar organismi, liverwort (Marchantia polymorpha).Sicut in Arabidopsis, semina tabaci SR-1 creverunt in medio, continens 25 μM KAND 11 radices breviores productas (fig. 5a).Accedit 40 ex 48 seminibus in catillis quibus 200 μM KAND 11 germinaverunt, cum omnia 48 semina in instrumentis ludibriis tractatis germinaverint, significans superiores concentrationes KAND significantes esse (p.< 0.05;chi test -square) germinationem tabaci inhibuit.(Fig. 5b).Praeterea intentio KAND 11 quae incrementum bacterial in hepatis inhibuit, similis fuit effectivis in Arabidopsis retrahitur (Fig. 5c).Hi eventus indicant KAND 11 incrementum variae plantae inhibere posse.Investigavimus igitur cytotoxicitatem possibilis ursi monoamidei relatarum compositorum in aliis organismis, nempe humana HeLa cellas et Escherichia coli cola DH5α, ut repraesentantes cellularum superiorum animalis et bacteriales.In serie prolificationis cellularum pertentationum animadvertimus acidum coumamonamidicum 1, coumamonamidicum 6, et KAND 11 incrementum HeLa vel E coli cellas ad collectiones 100 μM non afficere (Fig. 5d,e).
Augmentum inhibitionis KAND 11 in organismis non-arabidopsis.(a) Duo-septimana-genus silvestrium SR-I tabaci plantationes in directo positae in catillis MS laminis continentibus 25 μM KAND 11. natae sunt. MS catillae 200 μM KAND continentur 11. (c) Gemmae silvestres duae octo-vetus Tak-1 liverwort in Gamborg B5 gemmae creverunt, cum concentratione KAND indicatis 11. Sagittae rubrae indicant sporis, quae intra duas hebdomades incubationem crescere desierunt. aetati.(d) Cellula multiplicatio de- cellis HeLa.Numerus cellularum viablerum statis temporibus mensuratus est utens cella ornamentum 8 numerans (Dojindo).Ut imperium, cellulae HeLa tractatae sunt cum 5 μg/ml actinomycin D (Act D), quae transcriptionem RNA polymerasin inhibet et mortem cellam facit.Analyses fiebant in triplicata.(e) E. coli cella multiplicationis primordium.E. coli incrementum explicatur per OD600 metiendo.Ut imperium, cellae tractatae sunt cum 50 μg/ml ampicillino (Amp), quae synthesim bacterial murus cellae vetat.Analyses fiebant in triplicata.
Ad mechanismum actionis cytotoxicitatis ex compositorum uramide relatarum perspiciendis, derivationes acidum urbenicum cum modicis inhibitoribus effectibus reanalysi sumus.ut ex icone ostensum est.Ut in figuris ostenditur 2b, 6a, semina in laminas agaro natas continentium concentrationes (200 μM) acidi urmotonici 6 breviores et inflexae radices productae (θ = – 23.7 ± 6.1), semina autem in potestate media creverunt, etc. Seminibus fere rectae radices productae (θ = – 3.8 ± 7.1).Propria haec incrementi obliquus notus est ex dysfunctione microtubuli corticalis 14,18 provenire.Huic inventioni congruentia, medicamenta microtubula-destabilia disopyramida et oryzalin similia radicibus inclinatis sub condiciones nostrae incrementi inductae sunt (Fig. 2b, 6a).Eodem tempore derivationes acidum urmotonicum probavimus et complura ex eis excerpimus, qui in quibusdam concentratione obliquis radicibus incrementum induxerunt.Composita 8, 9, et 15 mutaverunt directionem radicis incrementi 75 μM, 50 µM, 40 µM, respective, significans compositiones istas microtubulas efficaciter destare posse (fig. 2b, 6a).Probavimus etiam potissimam acidum ursolicum derivativum KAND 11, in concentu minore (15 µM) et invenimus applicationem radicis incrementi KAND 11 inhibitam et directum incrementi radicis inaequalem esse, quamvis ad laevam praeceps tendebat ( Figura C3)..Quia superiores concentrationes microtubule-destabiles medicinae interdum incrementum plantae magis quam causam inclinatio inhibent, postea aestimavimus facultatem quam KAND 11 microtubulas afficit servando microtubulas corticales in cellulis radicum epidermalibus.Immunohistochemistica usus anti-β-tubulin elementorum in cellulis epidermalibus seminum radicum curatis 25 µM KAND 11 ostendit ablatione omnium fere microtubularum corticalium in cellulis epidermalibus in zona elongationis (fig. 6b).Hi eventus indicant acidum kumamotonicum eiusque derivationes directe vel indirecte agere in microtubulas ut eas perturbare possint et haec compositiones novas microtubulae inhibitores esse.
Acidum ursonicum eiusque derivationes microtubulae corticales in arabidopsis thaliana alterant.(a) Radix inclinationis angulus mensuratus coram variis derivationibus acidorum urmoticorum in concentratione indicatis.Effectus duarum compositorum notarum microtubularum inhibendi: disopyramide et oryzalino etiam enucleata sunt.Fundus ostendit regulam regulae usum ad modum augmenti rectus.Asterisci significant differentias cum simulata curatione (t test, p< 0.05).n>19. Scala bar = 1 cm.(b) Microtubulae corticales in cellulis epidermalibus in zona elongationis.Microtubulae in typo silvestri Arabidopsis Col radices in lamellis MS cum vel sine 25 µM KAND natae 11 subjiciuntur ab immunohistochemico maculatis utentes β-tubulin elementorum primariorum et Alexa Fluor-coniugatorum elementorum secundarium.Scala bar = 10 µm.(c) Mitotica structura microtubularum in radice meristem.Microtubulae subjiciuntur utentes immunohistochemico tinguentes.Mitoticae structurae, in quibus zonis prophetae, fusi et phragmoplastae, a imaginibus confocalibus numeratae sunt.Sagittae mitoticae microtubule structuras indicant.Asterisci significant differentias cum simulata curatione (t test, p< 0.05).n>9. Scala bar = 50 µm.
Quamvis Ursa facultatem microtubuli functionis perturbare habeat, eius mechanismus actionis expectatur diversum esse a microtubulae depolymerizing agentium typicam.Exempli gratia, superiores concentrationes agentium microtubuli depolymerizing sicut disopyramide et oryzalino inducunt expansionem cellarum epidermalium anisotropicam, cum KAND 11 non facit.Praeterea co-applicatio KAND 11 et disopyramidis in compositione disopyramidis radicis inductae responsionis incrementum et KAND 11 incrementum inhibitionis inductae observatum est (Fig. S4).Etiam responsionem disopyramidis hypersensitivae 1-1 mutamus ad KAND 11. phs1-1 tubulin kinasum punctum non canonicum mutationem habet et radices breviores disopyramide9 tractatas producit.phs1-1 mutant plantationes in medium agaro continens KAND 11 radices breviores similes iis quae in disopyramide natae sunt (fig. S5).
Observavimus praeterea structuras microtubulas mitoticas, ut zonas, fusos, et phragmoplastas prophetare, in radice meristem seminum cum KAND tractata 11. Cum animadversionibus CDKB2, 1p::CDKB2;1-GUS, notabile decrementum. numerus microtubularum mitoticorum observatus est (Fig. .6c).
Ad cytotoxicitatem KAND 11 subcellulares designandam, tobacco BY-2 cellas suspensionis cum KAND 11 tractavimus et eorum responsionem servavimus.KAND 11 primum ad cellulas BY-2I TagRFP-TUA6 expressas, quae microtubulas fluorescenter labellas, effectum KAND 11 in microtubulis corticalibus perpendere debemus.Densitas microtubulae corticalis aestimata est analysis imaginis utens, quae quantitavit elementa cytoskeletalium inter elementa cytoplasmica.Proventus primordium ostendit post curationem cum 50 μM vel 100 μM KAND 11 horae 1 , densitas signanter decrevit ad 0.94± 0.74% vel 0.23± 0.28%, densitas cellularum cum DMSO tractata respective ad 1.61±0.34 % (Fig. 7a).Hi eventus consentiunt observationi in Arabidopsis quod KAND 11 curatio inducit depolymerizationem microtubularum corticalium (Fig. 6b).Etiam lineam BY-2 cum filamentis actinis GFP-ABD intitulatis post curationem cum eadem intentione KAND 11 examinavimus et observavimus KAND 11 tractationem filamentorum actinorum dissolvisse.Curatio cum 50 μM vel 100 μM KAND 11 pro 1 h densitate filamentorum actinorum signanter reducta ad 1.20±0,62% vel 0.61± 0.26% respective, cum densitas in cellulis DMSO tractata erat 1.69±0.51% (Fig. 2).7b).Hi eventus discrepant cum effectibus propyzamidis, quae filamenta actin non afficit, et latrunculinum B, actin depolymerizer qui microtubulas non afficit (SI Figure S6).Curatio praeterea cum coumamonamide 1, acido coumamonamide 6, vel KAND 11 microtubulae in cellulis HeLa (SI Figura S7).Ita mechanismus actionis KAND 11 diversum esse creditur ac distractores notarum cytoskeleton.Praeterea nostra microscopica observatio HY-2 cellularum cum KAND 11 tractatarum incursum cellae mortis in curatione KAND 11 revelavit et ostendit proportionem Evans cellas mortuas caeruleas signanter post 30 min tractationis KAND 11 non augeri. post 90 minuta curationis cum 50 μM vel 100 μM KAND, cellularum mortuorum numerus ad 43.7% vel 80.1% auctus, respective (Fig. 7c).Simul sumpta, haec indicia indicant novum acidum ursolicum derivativum KAND 11 plantae specificae cytoskeletalis inhibitoris cum mechanismo actionis ignotae antea.
KAND afficit microtubulas corticales, filamenta actin et viability tabaci HY-2 cellulas.(a) Visualisatio microtubularum corticalium in cellulis BY-2 coram TagRFP-TUA6.Cellulae by-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO a microscopio confocal examinati sunt.Densitas microtubuli corticalis calculata ex micrographis cellularum 25 independens.Litterae significant differentias significantes (Tukey HSD test, p< 0.05).Scala bar = 10 µm.b) Corticales actinae filamenta per 2 cellulas coram GFP-ABD2 subjiciuntur.Cellulae by-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO a microscopio confocal examinati sunt.Densitas filamentorum corticalis e micrographis cellularum 25 independens computabatur.Litterae significant differentias significantes (Tukey HSD test, p< 0.05).Scala bar = 10 µm.(c) Observatio mortuorum BY-2 cellularum Evans caeruleae maculantis.Cellulae by-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO a microscopio lucido examinati sunt.n=3.Scala bar = 100 µm.
Inventio et applicatio novorum naturalium productorum significantes progressus varios vitae humanae aspectus, inter medicinam et agriculturam duxit.Investigatio historica peracta est ut utiles compositiones ex opibus naturalibus obtineat.Praesertim actinomycetes usui esse dinoscitur antibioticis antiparasiticis, nam nematodes propter facultatem generandi varias metabolitas secundarias ut avermectin, plumbum compositum ex ivermectin et bleomycin eiusque derivatis, medicinaliter utebantur ut agens anticancer 21,22.Varietas etiam compositionum herbicidarum ab actinomycetis inventae sunt, quarum nonnullae iam ad commercium 1,23.Ergo analysis actinomycete metabolitarum ad segregationem rerum naturalium cum operationibus biologicis desideratis consilium efficax habetur.In hoc studio novam compositionem coumamonamide a S. Werraensi repertam et feliciter perstringimus.Acidum ursonicum est medium syntheticum ab urbenamide eiusque derivatis.Complicatio radicis propria causare potest, moderatam praebere actionem herbicidalem fortem, et directe vel indirecte detrimentum plantae microtubulae.Sed mechanismus actionis acidi urmotonici ab illa microtubulae inhibitores existendi differre potest, quia KAND 11 etiam filamenta actin disrumpit et mortem cellam facit, suggerens mechanismum regulatorem quo acidum urmotonicum eiusque derivationes amplis structurarum cytoskeletalium influunt..
Praeterea accurata characterizationis acidi urbenonici adiuvabit ut mechanismum actionis acidi urbenonici melius cognoscat.Praesertim proximus finis est aestimare facultatem acidi ursonici ligandi ad microtubulas redactas determinare, utrum acidum ursonicum eiusque derivationes directe in microtubulas agant et eas depolymerizent, an actio eorum in microtubula destabilizationis resultet.Praeterea in casu ubi microtubulae scopum directum non sunt, situm actionis cognoscentes et peltas hypotheticas acidi ursonici in plantis cellis adiuvabunt adhuc proprietates compositorum affinium et possibilium ad meliorem actionem herbicidalem cognoscendam adiuvabunt.Nostra bioactivity tentamentum ostendit singularem facultatem cytotoxicam acidi ursonici in vegetatione plantarum qualia sunt arabidopsis thaliana, tobacco et hepatis, cum nec E. coli nec HeLa cellulae affectae sunt.Minima vel nulla toxicitas ad cellulas animales proficit derivationibus acidorum ursonicorum si sicut herbicides explicantur ad usum in agris agriculturae apertis.Etenim, cum microtubulae communes structurae in eukaryotibus sint, earum inhibitio selectiva in plantis postulatio est praecipua pro herbicidis.Exempli gratia, propyzamide, agens microtubulum depolymerizing quod directe ad tubulin ligat et polymerizationem stringit, herbicida adhibetur propter suam toxicitatem humilis cellulis animalibus 24 .E contra disopyramides, benzamides relatae, specialitates diversae scopo habent.Praeter microtubulas plantas, RH-4032 vel benzoxamides etiam microtubulas cellularum animalium vel oomycetes, respective, et zalilamide adhibentur ut fungicide ob phytotoxicitatem suam humilem 25, 26,27.Ursi nuper reperti eiusque derivationes selectivam cytotoxicitatem contra plantas exhibent, sed memorabile est ulteriores modificationes suum scopum specificitatem mutare, derivationes adiectis potentialiter praebere ad regimen fungi pathogenici vel oomycetae.
Proprietates singulares acidi urbenonici eiusque derivationes utilia sunt ad earum evolutionem sicut herbicides et ad instrumenta investigationis adhibendas.Momentum cytoskeleton in regenti plantae cellae figura divulgatum est.Studia antea docuerunt plantas implicatas mechanismos microtubuli corticalis ordinandi evolvisse, microtubulas dynamicas moderantes ad morphogenesim proprie moderandas.Magnus numerus moleculorum responsalis actionis microtubulae moderandae notae sunt, et investigatio cognata adhuc permanenti 3,4,28 est.Praesens intellectus microtubuli dynamicorum in plantis cellulis mechanismos microtubuli corticalis organizandi plene non explicat.Exempli gratia, licet tam disopyramides quam oryzalin microtubulas depolymerize possint, disopyramides gravem radicem detorquent dum oryzalin effectum relative mitem habet.Mutationes autem in tubulin, quae microtubulas stabiliunt, etiam dextrorotationem in radicibus causant, paclitaxel autem, quae etiam dynamica microtubula stabilit, non facit.Itaque perscrutantes et identidem scuta hypothetica acidi ursolici novas pervestigationes in microtubularum corticali plantis moderandis praebere debent.Item futurae comparationes chemicorum quae efficaces sunt ad incrementum perversorum promovendum, ut disopyramide, et minus efficax oeconomiae, ut acidum oryzalinum vel kumamotoricum, clues praebebit quomodo perversum incrementum fiat.
Alia ex parte, ordinationes cytoskeletales defensionis relatas alia possibilitas ad cytotoxicitatem acidi ursonici explicandi sunt.Infectio pathogeni seu introductio elicitoris in cellulas plantas interdum cytoskeleton et cellae subsequentis interitum affert.Exempli gratia, oomycete derivata cryptoxanthin relata est microtubulas et filamenta actin ante mortem tobacco cellae perturbare, simile iis quae in curatione KAND eveniunt 30,31.Similitudines inter responsa defensionis et responsionum cellularum ab acido ursonico inductae hypothesizent nos felis processuum cellularum communium, quamvis velocius et validius effectus acidi ursonici quam cryptoxanthin evidens sit.Tamen, studiis ostendimus distractionem filamentorum actinorum cellam mortem spontaneam promovere, quae non semper cum distractione microtubulae comitatur 29 .Praeterea videndum restat utrum pathogen vel elicitor vel causat incrementum radicis depravatae, sicut derivationes acidum ursonicum faciunt.Quapropter scientia hypothetica conjunctionis defensionis responsionum et cytoskeleton est quaestio attractiva dirigenda.Utendo praesentiam ponderis gravis hypotheticae compositorum ad acidum ursonicum pertinentium necnon derivationum variarum potentiarum varias facultates praebere possunt machinas cellularum ignotas oppugnare.
Composita, inventio et applicatio novorum compositorum, quae microtubule dynamica modulantur, methodos potentes praebebit ad mechanismos hypotheticos implicatos, quae in plantis cellulae figurae determinantur.Hoc in contextu, recenter enucleatum compositum acidum urmotonicum, quod microtubulas et filamenta actinarum afficit et mortem cellam inducit, opportunitatem praebere potest nexum inter microtubule imperium et has alias machinas interpretandi.Ita analysis chemica et biologica utens acidum urbenonicum nos adiuvabit ad intellegendas machinationes hypotheticas regulatorias quae plantam cytoskeleton regunt.
Inoculata S. werraensis MK493-CF1 in D mL elusa Erlenmeyer lagena continens 110 mL seminis mediae constans 2% (w/v) galactosi, 2% (w/v) Essentiae pastae, 1% (w/v) Compositio Bacto. .-soyton (Thermo Piscatoris Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) frumentum extractum (KOGOSTCH Co., Ltd. Japan), 0.2% (w/v) (NH4) 2SO4 et 0.2% CaCO3 in aqua deionizata.(PH 7.4 ante sterilizationem).Culturae semen in gyratorius shaker (180 rpm) incubabant 27°C per 2 dies.Productio culturae per fermentum status solidi.Semen culturae (7 ml) translatum est in lagena 500 ml K-1 continens 40 g productionis mediae constans 15 g hordei pressi (MUSO Co, Ltd. Iaponia) et 25 g aquae deionizatae (pH non adaequatae. ante sterilitatem).).Fermentum per XXX°C in tenebris per 14 dies peractum est.Fermentum materiae extractum est cum 40 ml/utrem EtOH et centrifugatum (1500 g, 4°C, 10 min).Cultura supernatant (60 ml) mixta ex 10% MeOH/EtOAc extracta est.Stratum organicum sub pressione reducta ad residuum obtinendum (59.5 mg), quae HPLC subiecta elutione gradiente subiecta est (0-10 minuta: 90%) in adversa periodo columnae (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 µm, ID. 10 mm × longitudo 250 mm) H2O/CH3CN, 10-35 minuta: 90% H2O/CH3CN ad 70% H2O/CH3CN (gradiens), 35-45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuta: 90% H2O /EtOH ad 100% EtOH (gradiens (gradiens), 155–200 min: 100% EtOH) ad ratem fluxus 1.5 ml/min, coumamonamide (1, 36.0 mg) remotus ut pulvis albus amorpho.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (D MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valorem computatum: 141,0659, valorem mensuratum: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semina Columbia (Col-0) ab Arabidopsis Resource Centre Biological (ABRC) impetrata sunt permissu investigationis usus.Semina col-0 propagata et conservata sunt sub condicionibus laboratoribus nostris et in plantis arabidopsis generis silvestribus usi sunt.Semina arabidopsis superficies sterilia et exculta in media fortitudine Murashige et Skoog medium continens 2% sucrosum (Fujifilm Wako Purum Chemicum), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino) acidum ethanesulfonicum (MES) (Fujifilm Wako Purum Chemicum ).) et 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ad 23 °C et lumen assiduum.Semina phs1-1 mutant ab T. Hashimoto (Nara Instituto Scientiae et Technologiae).
Semina iactandi SR-1 a T. Hashimoto (Instituti Scientiae et Technologiae Nara) adhibita sunt ut plantis tobacco silvestribus utebantur.Semina tabaci superficies sterilia sunt et in aqua sterili macerata per tres noctes ad germinationem promovendam, deinde in solutione dimidiae virium quae habent 2% sucrosam, 0.05% (w/v) MES, et 0.8% gummi gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige.et Skoog medium) cum pH 5.7 et incubatis 23°C sub luce perpetua.
Strain Tak-1 a T. Kohchi (Kyoto University) provisum est et ut unitas experimentalis ad studium hepatis adhibita est.Gemma ex plantis sterilibus excultis et patella in Gamborg B5 media (Fujifilm Wako Pure Chemical) continens 1% sucrosum et 0,3% gummi gellan et incubatum ad 23°C sub luce continua.
Tabaci BV-2 cellulae (Nicotiana tabacum L. cv. fulva flavo 2) a S. Hasezawa (University of Tokyo).BY-2S cellulae 95-plicae dilutae sunt in medio Linsmeier et Skoog modificato ac septimanatim suppletae cum acido 2,4-dichlorophenoxyacetico 32 .Cellula suspensio in rotario concussore ad 130 rpm 27°C in tenebris mixta est.Cellas lava cum 10 partibus medii solidi recentis et in eodem medio resuspendendi.PER-2 lineae cellulae transgenicae microtubule TagRFP-TUA6 vel staminis actini sub BRASSICA virus musivum 35S promotoris generati ut descripti 33,34,35.Hae lineae cellulae conservari possunt et conformari procedendi rationibus similibus adhibitis ad lineam cellulam originalis BY-2 .
HeLa cellulae in Dulbecco mutato medio aquilae (DMEM) excultae (Technologies vitae) suppletae sunt 10% foetus serum bubulum, 1.2 U/ml penicillinum, et 1.2 μg/ml streptomycinum in 37°C incubator cum 5% CO2.
Omnia experimenta in hoc manuscripto descripta facta sunt secundum normas et normas biosafetas Iaponicae.
Composita in sulfoxide dimethyl dissoluta (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ut solutiones stirpis in medio MS dilutae pro Arabidopsis et Tabaci seu Gamborg B5 mediae ad hepar.Nam radix incrementum inhibitionis primordium, plus quam 10 semina per laminam seminata sunt in medium agaro, continens indicatas compositiones vel DMSO.Semina 7 diebus in thalamo crescentia incubata sunt.Seminibus photographatae sunt et longitudo radicum mensurata est.Pro arabidopsis germinatio primordium, 48 semina per laminam in medio agaro seminata sunt, quae 200 μM composita vel DMSO.Semina arabidopsia in cubiculi incrementi creverunt et numerus germinatorum seminum 7 dierum post germinationem computatus est (dag).Pro tobacco germinatio primordium, 24 semina per laminam in medio agaro seminata sunt quae 200 μM KAND vel DMSO.Semina Tabaci in incrementum conclave creverunt et numerus germinatorum post 14 dies computatus est.Ad hepatis incrementum inhibitionis primordium, 9 embryones ex unaquaque lamina patella in medium agaro, continens concentrationes KAND vel DMSO indicatas et incubantes in cubiculi incrementi per 14 dies.
Seminibus uti maculatum cum 5 mg/ml propidium iodidum (PI) ad visualise radicis meristem ordinationem.PI signa a microscopio fluorescente observata sunt utens TCS SPE laser microscopii confocal intuens (Leica Microsystems).
Maculatio radicum histochemica cum β-glucuronidase (GUS) fiebat secundum protocollum Malami et Benfey36 descriptum.Plantationes in 90% acetono pernoctare fixae, maculatae 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-acidi glucuronici in quiddam GUS horae 1 et in solutione chloraldehydae hydratae positae.(hydrata chloralis 8 g, aqua 2 ml et glycerolum 1 ml) et observata differentiali impedimento microscopii utendo microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Radix anguli in 7-diebus annorum seminibus mensus sunt in laminas verticaliter positas.Metire angulum radicis a directione gravitatis vectoris, de quo in VI gradus.
Ordinatio microtubulae corticalis cum modificationibus minoribus ad protocollum descriptum observatum est.Anti- β-tubulin anticorpus (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) et Alexa Fluor 488 coniugati anti-mus IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) adhibita sunt ut prima et secundaria elementorum ante 1: 1000 et 1:100 dilutiones; condiderunt.Imagines fluorescentes quaesitae sunt utentes TCS SPE laseris confocale microscopii intuens (Leica Microsystems).Imagines Z-accipes acquire et maximam intensionem proiectiones crea secundum instructiones corporis fabricantis.
HeLa cellae multiplicatio tentamentum fiebat utendo Cellula computatione Kit 8 (Dojindo) secundum mandatum fabrica.
Augmentum coli DH5α mensurans cellam densitatis in culturae mensurando spectrophotometro ad 600 um (OD600).
Cytoskeletalis ordo in transgenic-by-2 cellulis observatus est usus microscopii fluorescentiae instructus cum fabrica confocal CSU-X1 (Yokogawa) et camera sCMOS (Zyla, Andor Technologia).Densitas cytoskeletalis ab analysi imaginis aestimata est, quae quantam recipis elementa cytoskeletalium inter pixella cytoplasmica in imaginibus confocalibus utentes programmata Imaginum Imaginum descriptarum 38,39.
Ad cellam mortem deprehendendam in cellulis BY-2, aliquot suspensionis cellae cum 0.05% Evans caeruleo per 10 minuta ad cella temperie incubata est.Evans selectivus blue tinctio cellularum mortuarum ab extrusione tinctura e cellulis viable ab integra plasmatis membrana pendet.Cellulae maculatae observatae sunt utens microscopio lucida campi (BX53, Olympus).
HeLa cellulae in DMEM auctae sunt cum 10% FBS in incubatore humidificato ad 37°C et 5% CO2.Cellulae tractatae sunt cum 100 μM KAND 11, acidum kumamonamic 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), vel 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) pro 6 h ad 37°C.Cellulae cum MetOH pro 10 min fixae et tunc cum acetate pro 5 min in cella temperie.Cellae fixae cum β-tubulino anticorpore primariae incubatae (1D4A4, Proteintech: 66240-1) dilutae sunt in 0.5% BSA/PBS per 2 horas, lotae 3 temporibus cum TBST, et tunc incubatae cum anticorpore caprae Alexa Fluor.488 1 m.– Mus IgG (Thermo Piscatoris Scientific: A11001) et 15 ng/ml 4′, 6-diamidino-2-phenylindolum (DAPI) dilutum in 0.5% BSA/PBS.Post lavationem cum TBST ter, cellulae maculatae observatae sunt in microscopio Eclipseos Ti-E inverso.Imagines captae sunt cum Hamamatsu ORCA-R2 CCD camera refrigerata utens programmate metaMorphi (Molecular machinis).
Post tempus: Iun-17-2024