Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatoris tui quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optimis eventibus, commendamus ut recentiorem versionem navigatoris tui utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer debilites). Interea, ut sustentationem continuam praebeamus, situm sine stylis vel JavaScript monstramus.
Inventio et usus utilis productorum naturalium vitam humanam emendare potest. Chemica incrementum plantarum inhibentia late ut herbicidae ad herbas coercendas adhibentur. Propter necessitatem variorum generum herbicidarum utendi, necesse est composita cum novis actionis mechanismis identificare. In hoc studio, novum compositum N-alkoxypyrroli, coumamonamidum, ex Streptomyce werraensi MK493-CF1 invenimus et processum synthesis integrum stabilivimus. Per probationes activitatis biologicae, invenimus acidum urs-monoamicum esse intermedium syntheticum urs-monoamidi et potentialem...inhibitor incrementi plantarumPraeterea, varia derivata acidi urbenonici elaboravimus, inter quae derivatum urbenyloxy (UDA), quod magnam vim herbicidam habet sine negative detrimento in incrementum cellularum HeLa. Invenimus etiam derivata acidi urmotonici microtubulos plantarum perturbare; insuper, KAND filamenta actini afficit et mortem cellularum inducit; hi effectus multiplices ab illis inhibitorum microtubulorum notorum differunt et novum mechanismum actionis acidi ursonici suggerunt, qui commodum magnum in evolutione novorum herbicidarum repraesentat.
Inventio et usus practicus productorum naturalium utilium et derivatorum eorum est modus qualitatem vitae humanae emendandi. Metabolitae secundariae a microorganismis, plantis et insectis productae ad progressus magnos in medicina et agricultura duxerunt. Multa antibiotica et medicamenta antileucaemiae ex productis naturalibus elaborata sunt. Praeterea, varia genera...pesticida, fungicida et herbicida ex his productis naturalibus extrahuntur ad usum in agricultura. Praesertim herbicidae ad herbas inutiliter coercendas instrumenta magni momenti sunt ad augendos proventus frugum in agricultura moderna, et varia genera compositorum iam commercialiter adhibentur. Plures processus cellulares in plantis, ut photosynthesis, metabolismus aminoacidorum, synthesis parietis cellularis, regulatio mitosis, signalatio phytohormonum, vel synthesis proteinorum, habentur scopi typici herbicidarum. Composita quae functionem microtubulorum inhibent sunt classis communis herbicidarum quae incrementum plantarum afficiunt regulationem mitoticam afficiendo.
Microtubuli sunt partes cytosceleti et late conservantur in cellulis eukaryoticis. Heterodimer tubulini constat ex α-tubulina et β-tubulina, protofilamenta microtubulorum linearia formantia, cum 13 protofilamentis structuram cylindricam formantibus. Microtubuli munera multiplicia in cellulis plantarum agunt, inter quae formam cellulae, divisionem cellulae, et translationem intracellularem determinant3,4. Cellulae plantarum microtubulos sub membrana plasmatica interphasica continent, et hi microtubuli corticales, ut dicuntur, ordinationem microfibrillarum cellulosarum per regulationem complexuum cellulosae synthase moderari putantur4,5. Microtubuli corticales cellularum epidermalum radicis, in zona celeris elongationis apicis radicis praesentis, lateraliter siti sunt, et microfibrae cellulosae hos microtubulos sequuntur et directionem expansionis cellularis limitant, ita elongationem cellularem anisotropicam promoventes. Ergo, functio microtubulorum arcte cum morphologia plantarum coniuncta est. Substitutiones aminoacidorum in genis tubulinum codificantibus distortionem ordinationum microtubulorum corticalium et incrementum sinistrorsum vel dextrorsum in *Arabidopsis* 6,7 efficiunt. Similiter, mutationes in proteinis microtubulorum associatis quae dynamicam microtubulorum regulant etiam ad incrementum radicis distortum ducere possunt 8,9,10,11,12,13. Praeterea, curatio herbicidis microtubulos perturbantibus, ut disopyramidum, quod etiam pretilachlorum appellatur, etiam incrementum radicis obliquum sinistrorsum efficit 14. Haec data indicant accuratam regulationem functionis microtubulorum criticam esse ad directionem incrementi plantae determinandam.
Varia genera inhibitorum microtubulorum inventa sunt, et haec medicamenta contributiones significantes investigationi cytosceleti, necnon agriculturae et medicinae attulerunt. Praesertim oryzalinum, composita dinitroanilina, disopyramidum, composita benzamido affinia, et analoga eorum functionem microtubulorum inhibere possunt et sic incrementum plantarum. Ideo late ut herbicidae adhibentur. Quoniam autem microtubuli pars magni momenti cellularum plantarum et animalium sunt, pleraque inhibitoria microtubulorum cytotoxica sunt utrique typo cellularum. Ergo, quamvis utilitas eorum ut herbicidae agnita sit, numerus limitatus agentium antimicrotubulorum ad usus practicos adhibetur.
*Streptomyces* genus familiae *Strptomyces* est, quae bacteria aerobia, gram-positiva, filamentosa comprehendit et late notum est propter facultatem suam producendi amplam varietatem metabolitorum secundariorum. Quapropter, inter praecipuas fontes novorum productorum naturalium biologice activorum habetur. In hoc studio, novum compositum, coumamonamidum appellatum, invenimus, quod ex *Streptomyce werraensis* MK493-CF1 et *S. werraensis* ISP 5486 segregatum est. Usi analysi spectrali et plena analysi spectrali, structura coumamonamidi descripta est et eius singularis sceleton N-alkoxypyrroli determinatum est. Synthesis. Acidum ursmonicale, intermedium syntheticum ursmonoamidi et derivatorum eius, inventum est incrementum et germinationem plantae exemplaris popularis *Arabidopsis thaliana* inhibere. In studio relationis structurae et activitatis, invenimus compositum cum C9 modificato ad acidum ursonicum, derivatum nonyloxy acidi ursonici (KAND) appellatum, effectum inhibitorium in incrementum et germinationem significanter augere. Notandum est inhibitorem incrementi plantarum nuper inventum etiam incrementum tobaci et hepaticae afficere neque bacteriis aut cellulis HeLa cytotoxicum fuisse. Praeterea, nonnulla derivata acidi urmotonici phaenotypum radicis distortum inducunt, quod significat haec derivata directe vel indirecte microtubulos afficere. Cum hac idea congruentes, observationes nostrae microtubulorum vel immunohistochemice vel proteinis fluorescentibus signatorum indicant curationem KAND microtubulos depolymerizare. Accedit quod curatio derivatis acidi kumamotonici microfilamenta actini perturbavit. Itaque novum inhibitorem incrementi plantarum invenimus cuius unicus actionis mechanismus destructionem cytosceleti implicat.
Stirps MK493-CF1 e solo in Shinagawa-ku, Tokii, separata est. Stirps MK493-CF1 mycelium stromalem bene ramosum formavit. Sequentia partialis geni RNA ribosomalis 16S (1422 bp) determinata est. Haec stirps S. werraensis valde similis est (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: stirps typica, 99.93%). Hoc resultato innixa, determinatum est hanc stirpem stirpi typicae S. werraensis arcte cognatam esse. Quapropter hanc stirpem provisionaliter S. werraensis MK493-CF1 nominavimus. S. werraensis ISP 5486T etiam eadem composita bioactiva producit. Cum parvae investigationes initiales de productis naturalibus ex hoc microorganismo obtinendis exstiterint, ulteriores investigationes chemicae peractae sunt. Post culturam *S. werraensis* MK493-CF1 in medio hordeaceo per fermentationem in statu solido ad 30°C per 14 dies, medium cum 50% EtOH extractum est. 60 ml exempli exsiccati sunt, ut 59.5 mg extracti crudi obtinerentur. Extractum crudum HPLC phasis reversae subiectum est, ut N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamidum (1, coumamonamidum nominatum, 36.0 mg) daretur. Quantitas totalis 1 circiter 60% extracti crudi est. Quapropter, proprietates kumamotoamidi 1 accurate studere decrevimus.
Coumamonamidum 1 est pulvis amorphus albus et spectrometria massae altae resolutionis (HRESIMS) C6H8N2O2 confirmat (Fig. 1). Fragmentum pyrroli C2-substitutum huius compositi distinguitur per δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH in spectro 1H NMR: 4.5 Hz, H-5) et δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), et spectrum 13C NMR praesentiam quattuor atomorum carbonii sp2 ostendit. Praesentia gregis amidi in positione C2 aestimata est per correlationem HMBC a protone C-3 ad carbonium carbonylicum amidi in δC 161.1. Praeterea, cacumina 1H et 13C NMR apud δH 4.10 (3H, S) et δC 68.3 praesentiam gregum N-methoxy in molecula indicant. Quamquam positio correcta gregis methoxy nondum determinata est per analysin spectroscopicam, qualis est spectroscopia differentiae amplificatae et abbreviatio nuclearis Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamidum primum compositum candidatum factum est.
Ad structuram rectam 1 determinandam, synthesis totalis peracta est (Fig. 2a). Tractatio 2-aminopyridini 2 commercialiter praesto cum m-CPBA in correspondente N-oxido 3 quantitativo proventu effecit. Post 2-aminoazidationem 2, reactio cyclocondensationis ab Abramovich descripta in benzeno ad 90°C peracta est ad desideratum 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrilum 5 in grammis obtinendum. Celeritas 60% (duo gradus). 15,16. Methylatio et hydrolysis 4 deinde acidum 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylicum (acidum cumotonicum appellatum, 6) bono proventu (70%, duo gradus) dederunt. Denique amidatio per intermedium acidi chloridi 6 utens ammonia aquosa Kumamoto amidum 1 bono proventu dedit. Omnia data spectralia synthesizati 1 similia erant isolati 1, ita structura 1 determinata est;
Synthesis generalis et analysis activitatis biologicae urbenamidi et acidi urbenici. (a) Synthesis totalis amidi Kumamoto. (b) Plantulae Arabidopsis Columbia (Col) typi naturalis septem dierum in laminis Murashige et Skoog (MS) cultae sunt, quae coumamonamidum 6 vel coumamonamidum 1 in concentrationibus indicatis continent. Scala linearis = 1 cm.
Primo, actiones biologicas urbenamidi et intermediariorum eius quoad facultatem incrementum plantarum moderandi aestimavimus. Varias concentrationes ursmonamidi 1 vel acidi ursmonici 6 medio MS agar addidimus et plantulas Arabidopsis thaliana in hoc medio cultivavimus. Hae probationes demonstraverunt altas concentrationes (500 μM) 6 incrementum radicum inhibere (Fig. 2b). Deinde, varia derivata generavimus substituendo positionem N1 6 et studia relationis structurae et activitatis in eis perfecimus (processus synthesis analogae in Informatione Supplementi (SI) describitur). Plantulae Arabidopsis in medio continenti 50 μM derivatorum acidi ursonici cultae sunt, et longitudo radicis mensurata est, ut in imagine ostenditur. Ut in Figuris 3a, b, et S1 ostenditur, acida coumamo diversas longitudines catenarum alkoxy linearum (9, 10, 11, 12, et 13) vel magnarum catenarum alkoxy (15, 16, et 17) in positione N1 habent. Derivata inhibitionem significantem incrementi radicum demonstraverunt. Praeterea, invenimus applicationem 200 μM 10, 11, vel 17 germinationem inhibuisse (Fig. 3c et S2).
Studium relationis structurae et activitatis amidi Kumamoto et compositorum similium. (a) Structura et schema synthesis analogorum. (b) Quantificatio longitudinis radicum plantularum septem dierum in medio MS cum vel sine 50 μM derivatis coumamonamidis cultarum. Asterisci differentias significantes cum curatione ficta indicant (test t, p< 0.05). n>18. Data ut media ± deviatio standardis (SD) monstrantur. nt significat "non probatum" quia plus quam 50% seminum non germinaverunt. (c) Quantificatio germinationis rationis seminum tractatorum, per 7 dies incubatorum in medio MS cum vel sine 200 μM coumamonamidi et compositis similibus. Asterisci differentias significantes cum curatione ficta (test chi-quadratum) indicant. n=96.
Curiose, additio catenarum lateralium alkylarum longiorum quam C9 actionem inhibitoriam minuit, quod indicat composita acidi kumamotoici affinia catenas laterales certae magnitudinis requirere ut actionem biologicam suam exhibeant.
Quia analysis nexus structurae et activitatis demonstravit C9 in acidum ursonicum modificatum esse et derivatum nonyloxy acidi ursonici (deinceps KAND 11 appellatum) inhibitorem accretionis plantarum efficacissimum fuisse, descriptionem KAND 11 accuratiorem perfecimus. Tractatio Arabidopsis cum 50 μM KAND 11 germinationem fere omnino impedivit, dum concentrationes inferiores (40, 30, 20, vel 10 μM) KAND 11 accretionem radicis modo dosi dependente inhibuerunt (Fig. 4a, b). Ut exploraremus num KAND 11 viabilitatem meristematis radicis afficiat, meristemata radicis iodido propidii (PI) tincta examinavimus et magnitudinem areae meristematis mensuravimus. Magnitudo meristemi plantularum in medio continenti 25 μM KAND-11 cultarum erat 151.1 ± 32.5 μm, dum magnitudo meristemi plantularum in medio comparationis continenti DMSO cultarum erat 264.7 ± 30.8 μm (Fig. 4c, d), quod indicat KAND-11 activitatem cellularem restituere. propagatio. Meristema radicis. Hoc congruenter, curatio KAND 11 quantitatem signi divisionis cellularis CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS in meristema radicis minuit (Fig. 4e) 17. Haec eventa indicant KAND 11 incrementum radicis inhibere per reductionem activitatis proliferationis cellularis.
Analysis effectus inhibitorii derivatorum acidi urbenonici (derivatorum urbenyloxy) in incrementum. (a) Plantulae Col typi naturalis septem dierum, in laminis MS cum concentrationibus indicatis KAND 11 cultae. Scala linearis = 1 cm. (b) Quantificatio longitudinis radicis. Litterae differentias significantes indicant (test Tukey HSD, p< 0.05). n>16. Data ut media ± deviatio standardis (SD) monstrantur. (c) Microscopia confocalis radicum Col typi naturalis tinctarum iodido propidio, in laminis MS cum vel sine 25 μM KAND 11 cretarum. Uncini albi meristema radicis indicant. Scala = 100 µm. (d) Quantificatio magnitudinis meristemi radicis (n = 10 ad 11). Differentiae statisticae determinatae sunt utens probatione t (p< 0.05). Virgae magnitudinem meristemi mediam repraesentant. (e) Microscopia differentialis interferentiae contrastus (DIC) meristemi radicis continentis constructum CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS tincta et tincta in plantulis quinque dierum natis cultis in laminis MS cum vel sine 25 µM KAND test.
Phytotoxicitas KAND 11 ulterius examinata est utens alia planta dicotyledona, tabaco (Nicotiana tabacum), et organismo exemplari plantae terrestris maiori, hepatica (Marchantia polymorpha). Sicut in casu Arabidopsis, plantulae tabaci SR-1, in medio continenti 25 μM KAND 11 cultae, radices breviores produxerunt (Fig. 5a). Praeterea, 40 ex 48 seminibus germinaverunt in laminis continentibus 200 μM KAND 11, dum omnia 48 semina germinaverunt in medio simulato tractato, quod indicat maiores concentrationes KAND significantes esse (p...).< 0.05; test chi -quadratum) germinationem tabaci inhibuit. (Fig. 5b). Praeterea, concentratio KAND 11 quae incrementum bacteriale in hepatica inhibuit similis erat concentrationi efficaci in Arabidopsis (Fig. 5c). Haec eventa indicant KAND 11 incrementum varietatis plantarum inhibere posse. Deinde cytotoxicitatem possibilem compositorum monoamidis ursi affinium in aliis organismis, nominatim cellulis HeLa humanis et stirpe Escherichia coli DH5α, ut repraesentativa cellularum animalium superiorum et bacterialium, respective, investigavimus. In serie experimentorum proliferationis cellularum, observavimus coumamonamidum 1, acidum coumamonamidicum 6, et KAND 11 incrementum cellularum HeLa vel E. coli in concentrationibus 100 μM non afficere (Fig. 5d,e).
Inhibitio accretionis KAND 11 in organismis non-Arabidopsis. (a) Plantae tabaci SR-1 typi naturalis duarum hebdomadarum in laminis MS verticaliter positis, continentibus 25 μM KAND 11, creverunt. (b) Plantae tabaci SR-1 typi naturalis duarum hebdomadarum in laminis MS horizontaliter positis, continentibus 200 μM KAND 11, creverunt. (c) Gemmae hepaticae Tak-1 typi naturalis duarum hebdomadarum in laminis Gamborg B5 cum concentrationibus indicatis KAND 11 cultae. Sagittae rubrae sporas indicant quae intra periodum incubationis duarum hebdomadarum crescere desierunt. (d) Examen proliferationis cellularum HeLa. Numerus cellularum viabilium intervallis temporis fixis mensus est utens apparatu numerandi cellulas 8 (Dojindo). In exemplo, cellulae HeLa tractatae sunt cum 5 μg/ml actinomycini D (Act D), quae transcriptionem RNA polymerasis inhibet et mortem cellularum causat. Analyses triplicatae peractae sunt. (e) Examen proliferationis cellularum E. coli. Accretio E. coli analysata est mensurando OD600. In comparatione, cellulae ampicillini (Amp) 50 μg/ml tractatae sunt, quod synthesim parietis cellularis bacterialis inhibet. Analyses triplicatae sunt.
Ad mechanismum actionis cytotoxicitatis a compositis uramidis affinibus causatae interpretandum, derivata acidi urbenici cum effectibus inhibitoriis moderatis reanalyzavimus, ut in imagine demonstratur. Ut in Figuris 2b, 6a demonstratur, plantulae in laminis agarianis cum magnis concentrationibus (200 μM) acidi urmotonici 6 cultae radices breviores et ad sinistram curvatas (θ = – 23.7 ± 6.1) produxerunt, cum plantulae in medio comparationis cultae radices fere rectas produxerint (θ = – 3.8 ± 7.1). Haec incrementum obliquum characteristicum ex dysfunctione microtubulorum corticalium provenire notum est14,18. Congruenter cum hoc invento, medicamenta microtubulos destabilizantia, disopyramidum et oryzalinum, similem inclinationem radicum sub nostris condicionibus incrementi induxerunt (Figuris 2b, 6a). Simul, derivata acidi urmotonici probavimus et plura ex eis delegimus quae, certis concentrationibus, incrementum radicum obliquum induxerunt. Composita 8, 9, et 15 directionem accretionis radicis mutaverunt ad 75 μM, 50 μM, et 40 μM respective, quod indicat haec composita microtubulos efficaciter destabilizare posse (Fig. 2b, 6a). Etiam potentissimum derivatum acidi ursolici, KAND 11, ad minorem concentrationem (15 µM) probavimus et invenimus applicationem KAND 11 accretionem radicis inhibuisse et directionem accretionis radicis inaequalem esse, quamquam ad sinistram vergere tendebant (Figura C3). Quia maiores concentrationes medicamentorum microtubulos destabilizantium interdum accretionem plantarum potius inhibent quam inclinationem radicis efficiant, deinde possibilitatem KAND 11 microtubulos afficere aestimavimus observando microtubulos corticales in cellulis epidermalibus radicum. Immunohistochemia utens anticorporibus anti-β-tubulinis in cellulis epidermalibus radicum plantularum tractatarum cum 25 μM KAND 11 ostendit evanescentiam fere omnium microtubulorum corticalium in cellulis epidermalibus in zona elongationis (Fig. 6b). Haec eventa indicant acidum kumamotonicum et eius derivata directe vel indirecte in microtubulos agere ut eos perturbent et haec composita nova inhibitoria microtubulorum esse.
Acidum ursonicum et eius derivata microtubulos corticales in *Arabidopsis thaliana* alterant. (a) Angulus inclinationis radicis mensus in praesentia variorum derivatorum acidi urmotonici ad concentrationes indicatas. Effectus duorum compositorum, quae microtubulos inhibere nota sunt: disopyramidi et oryzalini, etiam analysati sunt. Insertio ostendit normam adhibitam ad angulum accretionis radicis metiendum. Asterisci differentias significantes cum curatione ficta indicant (test t, p-).< 0.05). n>19. Scala = 1 cm. (b) Microtubuli corticales in cellulis epidermalibus in zona elongationis. Microtubuli in radicibus Arabidopsis Col typi naturalis, in laminis MS cum vel sine 25 μM KAND 11 cultis, per tinctionem immunohistochemicam visualizati sunt, anticorporibus primariis β-tubulinis et anticorporibus secundariis Alexa Fluor-coniugatis utens. Scala = 10 µm. (c) Structura mitotica microtubulorum in meristemo radicis. Microtubuli per tinctionem immunohistochemicam visualizati sunt. Structurae mitoticae, inter quas zonae prophasis, fusi et phragmoplasta, ex imaginibus confocalibus numeratae sunt. Sagittae structuras microtubulorum mitoticorum indicant. Asterisci differentias significantes cum curatione ficta indicant (test t, p< 0.05). n>9. Scalae linea = 50 µm.
Quamquam Ursa facultatem habet functionem microtubulorum perturbandi, eius mechanismus actionis a typicis agentibus depolymerizantibus microtubulorum differre exspectatur. Exempli gratia, maiores concentrationes agentium depolymerizantium microtubulorum, ut disopyramidum et oryzalini, expansionem anisotropicam cellularum epidermalium inducunt, cum KAND 11 non faciat. Praeterea, co-applicatio KAND 11 et disopyramidi responsum accretionis radicum a disopyramide inductum combinatum effecit et inhibitio accretionis a KAND 11 inducta observata est (Fig. S4). Etiam responsum mutantis hypersensibilis disopyramidi 1-1 (phs1-1) ad KAND 11 analyzavimus. phs1-1 mutationem punctualem tubulin kinase non canonicam habet et radices breviores producit cum disopyramide tractatur9,20. Plantulae mutantes phs1-1 in medio agaro KAND 11 continenti cultae radices breviores similes illis in disopyramide cultae habebant (fig. S5).
Praeterea, structuras microtubulorum mitoticorum, ut zonas prophasis, fusos, et phragmoplasta, in meristeme radicis plantularum KAND 11 tractatarum observavimus. Congruenter cum observationibus pro CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, significans diminutio in numero microtubulorum mitoticorum observata est (Fig. .6c).
Ad cytotoxicitatem KAND 11 resolutione subcellulari describendam, cellulas suspensionis BY-2 tabaci cum KAND 11 tractavimus earumque responsionem observavimus. Primum KAND 11 cellulis BY-2 TagRFP-TUA6 exprimentibus, qui microtubulos fluorescentibus notat, addidimus ut effectum KAND 11 in microtubulos corticales aestimaremus. Densitas microtubulorum corticalium per analysin imaginum aestimata est, quae percentationem pixelorum cytosceletalium inter pixelos cytoplasmaticos quantificavit. Resultata experimenti demonstraverunt post tractationem cum 50 μM vel 100 μM KAND 11 per horam unam, densitatem significanter ad 0.94 ± 0.74% vel 0.23 ± 0.28% respective decrevisse, dum densitas cellularum cum DMSO tractatarum ad 1.61 ± 0.34% pervenit (Fig. 7a). Haec resultata congruunt cum observatione in Arabidopsis quod tractatio KAND 11 depolymerizationem microtubulorum corticalium inducit (Fig. 6b). Lineam BY-2 cum filamentis actinis GFP-ABD-signatis post curationem eadem concentratione KAND 11 examinavimus et observavimus curationem KAND 11 filamenta actini perturbasse. Curatio cum 50 μM vel 100 μM KAND 11 per 1 h densitatem filamentorum actinis significanter ad 1.20 ± 0.62% vel 0.61 ± 0.26% respective redegit, cum densitas in cellulis DMSO-tractatis 1.69 ± 0.51% esset (Fig. 2). 7b). Haec eventa discrepant cum effectibus propyzamidi, quod filamenta actinis non afficit, et latrunculini B, depolymerizatoris actini qui microtubulos non afficit (Figura S6 in Figura S6). Praeterea, curatio cum coumamonamido 1, acido coumamonamidico 6, vel KAND 11 microtubulos in cellulis HeLa non affecit (Figura S7 in Figura S7 in Figura S7). Itaque, mechanismus actionis KAND 11 creditur differre ab eo perturbatorum cytosceleti notorum. Praeterea, nostra observatio microscopica cellularum BY-2 cum KAND 11 tractatarum initium mortis cellularis per curationem KAND 11 revelavit et demonstravit proportionem cellularum mortuarum caeruleo Evans tinctarum non significanter auctam esse post 30 minuta curationis KAND 11, cum post 90 minuta curationis cum 50 μM vel 100 μM KAND, numerus cellularum mortuarum ad 43.7% vel 80.1%, respective, auctus sit (Fig. 7c). Haec data simul sumpta indicant novum derivatum acidi ursolici KAND 11 esse inhibitorem cytosceleti plantae specificum cum mechanismo actionis antea ignoto.
KAND microtubulos corticales, filamenta actini, et vitalitatem cellularum BY-2 tabaci afficit. (a) Visualizatio microtubulorum corticalium in cellulis BY-2 in praesentia TagRFP-TUA6. Cellulae BY-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO per microscopiam confocalem examinatae sunt. Densitas microtubulorum corticalium ex micrographis 25 cellularum independentium calculata est. Litterae differentias significantes indicant (test Tukey HSD, p< 0.05). Scala = 10 µm. (b) Filamenta actini corticalia in cellulis BY-2 visualizata in praesentia GFP-ABD2. Cellulae BY-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO examinatae sunt per microscopiam confocalem. Densitas filamentorum actini corticalium calculata est ex micrographiis 25 cellularum independentium. Litterae differentias significantes indicant (test Tukey HSD, p< 0.05). Scalae linea = 10 µm. (c) Observatio cellularum BY-2 mortuarum per tinctionem caeruleam Evans. Cellulae BY-2 tractatae cum KAND 11 (50 μM vel 100 μM) vel DMSO examinatae sunt per microscopiam campi lucidi. n=3. Scalae linea = 100 µm.
Inventio et applicatio novorum productorum naturalium ad progressus magnos in variis aspectibus vitae humanae, inter quos medicina et agricultura, duxit. Investigationes historicae peractae sunt ad composita utilia ex opibus naturalibus obtinenda. Praesertim, actinomyceta nota sunt ut antibiotica antiparasitica contra nematoda propter facultatem producendi varios metabolitos secundarios, ut avermectinum, compositum principale ivermectini et bleomycini eiusque derivatos, medicinaliter ut agens anticancerosum adhibitum21,22. Similiter, varia composita herbicida ex actinomycetis inventa sunt, quorum nonnulla iam commercialiter adhibentur1,23. Ergo, analysis metabolitorum actinomycetorum ad producta naturalia cum actionibus biologicis desideratis isolanda strategia efficax habetur. In hoc studio, novum compositum, coumamonamidum, ex S. werraensi invenimus et feliciter synthetizavimus. Acidum ursonicum est intermedium syntheticum urbenamidi et derivatorum eius. Crispationem radicum characteristicam causare potest, actionem herbicidam moderatam ad fortem exhibere, et microtubulos plantarum directe vel indirecte laedere. Attamen, ratio actionis acidi urmotonici ab ea inhibitorum microtubulorum existentium differre potest, cum KAND 11 etiam filamenta actini perturbet et mortem cellularum efficiat, quod mechanismum regulatorium suggerit quo acidum urmotonicum et eius derivata amplam varietatem structurarum cytosceletalium afficiunt.
Ulterior accurata descriptio acidi urbenonici adiuvabit ad melius intellegendum mechanismum actionis acidi urbenonici. Praesertim, proximus finis est aestimare facultatem acidi ursonici ad microtubulos reductos ligandi, ut determinetur utrum acidum ursonicum et eius derivata directe in microtubulos agant et eos depolymerizent, an eorum actio destabilisationem microtubulorum efficiat. Praeterea, in casu ubi microtubuli non sunt scopus directus, identificatio loci actionis et scoporum molecularium acidi ursonici in cellulis plantarum adiuvabit ad ulterius intellegendas proprietates compositorum affinium et vias possibiles ad actionem herbicidam emendandam. Nostra probatio bioactivitatis demonstravit singularem facultatem cytotoxicam acidi ursonici in incremento plantarum sicut Arabidopsis thaliana, tabaci et hepatica, dum neque E. coli neque cellulae HeLa affectae sunt. Parva vel nulla toxicitas cellulis animalium est commodum derivatorum acidi ursonici si ut herbicidae ad usum in agris agriculturae apertis explicantur. Re vera, cum microtubuli sint structurae communes in eukaryotis, eorum inhibitio selectiva in plantis est requisitum clavis pro herbicidis. Exempli gratia, propyzamidum, agens depolymerizationis microtubulorum quod directe tubulino se iungit et polymerizationem inhibet, ut herbicida adhibetur propter eius humilem toxicitatem in cellulis animalium24. Contra disopyramidum, benzamida affinia diversas specificitates scoporum habent. Praeter microtubulos plantarum, RH-4032 vel benzoxamidum etiam microtubulos cellularum animalium vel oomycetum, respective, inhibet, et zalilamidum ut fungicida adhibetur propter suam humilem phytotoxicitatem25,26,27. Ursus nuper inventus et eius derivata cytotoxicitatem selectivam contra plantas exhibent, sed notandum est modificationes ulteriores specificitatem scoporum eorum mutare posse, potentialiter derivata addita ad fungos pathogenos vel oomycetum moderandos praebentes.
Proprietates singulares acidi urbenonici et derivatorum eius utiles sunt ad eorum evolutionem tamquam herbicidas et usum tamquam instrumenta investigationis. Momentum cytosceleti in moderanda forma cellularum plantarum late agnoscitur. Studia priora demonstraverunt plantas mechanismos complexos ordinationis microtubulorum corticalium evolvisse per moderationem dynamicae microtubulorum ad morphogenesin recte moderandam. Magnus numerus molecularum quae moderationem activitatis microtubulorum responsabiles sunt identificatus est, et investigatio conexa adhuc pergit3,4,28. Nostra praesens comprehensio dynamicae microtubulorum in cellulis plantarum non plene explicat mechanismos ordinationis microtubulorum corticalium. Exempli gratia, quamquam et disopyramidum et oryzalinum microtubulos depolymerizare possunt, disopyramidum distortionem radicum gravem causat, dum oryzalinum effectum relative lenem habet. Praeterea, mutationes in tubulino, quae microtubulos stabilizat, etiam dextrorotationem in radicibus causant, cum paclitaxel, quod etiam dynamicam microtubulorum stabilizat, non efficiat. Ergo, studium et identificatio scoporum molecularium acidi ursolici novas perspicientias in moderationem microtubulorum corticalium plantarum praebere debet. Similiter, comparationes futurae chemicarum quae efficacia sunt in promovendo incrementum distortum, ut disopyramidum, et chemicarum minus efficacium, ut oryzalinum vel acidum kumamotoricum, indicia praebebunt quomodo incrementum distortum fiat.
Ex altera parte, rearrangementa cytosceleti ad defensionem pertinentia alia possibilitas sunt ad cytotoxicitatem acidi ursonici explicandam. Infectio pathogeni vel introductio elicitoris in cellulas plantarum interdum destructionem cytosceleti et subsequentem mortem cellularem efficit29. Exempli gratia, cryptoxanthinum ab oomycete derivatum microtubulos et filamenta actini ante mortem cellularum tabaci perturbare relatum est, simile ei quod cum curatione KAND fit30,31. Similitudines inter responsa defensiva et responsa cellularia ab acido ursonico inducta nos ad hypothesim perduxerunt ea processus cellulares communes excitare, quamquam effectus acidi ursonici velocior et fortior quam cryptoxanthini manifestus est. Attamen, studia demonstraverunt perturbationem filamentorum actini mortem cellularem spontaneam promovere, quae non semper perturbatione microtubulorum comitatur29. Praeterea, restat videre utrum vel pathogenum vel elicitor incrementum radicum distortum causet, sicut derivata acidi ursonici faciunt. Ergo, cognitio molecularis responsa defensiva et cytosceletum coniungens problema attractivum est quod tractandum est. Experientia compositorum ponderis molecularis humilis, acido ursonico similium, necnon serie derivatorum cum variis potentiis utens, fortasse occasiones praebent ad mechanismos cellulares ignotos petendos.
Summa summarum, inventio et applicatio novorum compositorum quae dynamicam microtubulorum modulant methodos potentes praebebunt ad mechanismos moleculares complexos subiacentes determinationi formae cellularum plantarum tractandos. In hoc contextu, compositum nuper elaboratum acidum urmotonicum, quod microtubulos et filamenta actini afficit et mortem cellularem inducit, occasionem praebere potest ad nexum inter moderationem microtubulorum et hos alios mechanismos interpretandum. Ergo, analysis chemica et biologica utens acido urbenonico nobis adiuvabit ad mechanismos regulatorios moleculares qui cytosceleto plantarum gubernant intellegendos.
S. werraensis MK493-CF1 in lagenam Erlenmeyer 500 mL capacitatis, continentem 110 mL medii seminum constantem ex 2% (w/v) galactosa, 2% (w/v) pasta Essentiae, 1% (w/v) compositione Bacto-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) extracto frumenti (KOGOSTCH Co., Ltd., Iaponia), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 et 0.2% CaCO3 in aqua deionizata (pH 7.4 ante sterilisationem). Culturae seminum in agitatore rotatorio (180 rpm) ad 27°C per 2 dies incubatae sunt. Cultura productio per fermentationem in statu solido. Cultura seminum (7 ml) in lagenam K-1 500 ml translata est, continentem 40 g medii productionis, constantem ex 15 g hordei pressi (MUSO Co., Ltd., Iaponia) et 25 g aquae deionizatae (pH non adaptatum ante sterilisationem). Fermentatio ad 30°C in tenebris per 14 dies peracta est. Materia fermentationis extracta est cum 40 ml/lagena EtOH et centrifugata (1500 g, 4°C, 10 min). Supernatans culturae (60 ml) extractum est cum mixtura 10% MeOH/EtOAc. Stratum organicum sub pressione reducta evaporatum est, residuum (59.5 mg) obtinendum, quod HPLC cum elutione gradiente (0-10 minuta: 90%) in columna phasis reversae (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × longitudo 250 mm) H2O/CH3CN subiectum est, 10-35 minuta: 90% H2O/CH3CN ad 70% H2O/CH3CN (gradiens), 35-45 minuta: 90% H2O/EtOH, 45-155 minuta: 90% H2O/EtOH ad 100% EtOH (gradiens (gradiens), 155-200 min: 100% EtOH) cum fluxu 1.5 ml/min, coumamonamidum (1, 36.0 mg) ut pulvis albus amorphus separatum est.
Kumamotoamidum(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ valor computatus: 141.0659, valor mensus: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Semina Columbiae (Col-0) ex Centro Subsidiorum Biologicorum Arabidopsis (ABRC) cum permissione ad usum inquisitivum obtenta sunt. Semina Col-0 sub condicionibus nostris laboratorium propagata et conservata sunt, et ut plantae Arabidopsis typi naturalis adhibita sunt. Semina Arabidopsis superficialiter sterilizata et in medio Murashige et Skoog dimidiae fortitudinis, continenti 2% saccharosum (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) acidi 2-(4-morpholino)ethanesulfonici (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical), et 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ad 23°C et lucem constantem, culta sunt. Semina mutantis phs1-1 a T. Hashimoto (Instituto Scientiae et Technologiae Narae) provisa sunt.
Semina stirpis SR-1 a T. Hashimoto (Instituto Scientiae et Technologiae Narae) suppedita sunt et ut plantae tabaci sylvestris adhibita sunt. Semina tabaci superficie sterilizata et in aqua sterili per tres noctes macerata sunt ad germinationem promovendam, deinde in solutione dimidiae fortitudinis continenti 2% saccharosum, 0.05% (w/v) MES, et 0.8% gummi gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. et Skoog medium) cum pH 5.7 posita et ad 23°C sub luce constanti incubata.
Stirps Tak-1 a T. Kohchi (Universitate Kyoto) suppedita est et ut unitas experimentalis norma pro studio hepaticarum adhibita est. Gemma ex plantis sterilibus cultis obtenta est, deinde in medio Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) continenti 1% saccharosum et 0.3% gummi gellan sparsa et sub luce continua ad 23°C incubata.
Cellulae BY-2 tabaci (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) a S. Hasezawa (Universitate Tokiensi) suppeditatae sunt. Cellulae BY-2 95-pliciter in medio Linsmeier et Skoog modificato dilutae et hebdomadaliter acido 2,4-dichlorophenoxyacetico 32 suppletae sunt. Suspensio cellularum in agitatore rotatorio ad 130 rpm ad 27°C in tenebris mixta est. Cellulae decies volumine medii recentis lavantur et in eodem medio resuspendantur. Lineae cellularum transgenicae BY-2 stabile exprimentes signum microtubulorum TagRFP-TUA6 vel signum filamenti actini GFP-ABD2 sub promotore 35S virus mosaici caulifloris generatae sunt ut descriptum 33,34,35. Hae lineae cellularum conservari et synchronizari possunt utens processibus similibus illis quae pro linea cellularum BY-2 originali adhibitae sunt.
Cellulae HeLa in medio Dulbecco modificato Eagle (DMEM) (Life Technologies) supplemento 10% sero bovino fetali, 1.2 U/ml penicillini, et 1.2 μg/ml streptomycini, in incubatore 37°C cum 5% CO2, cultae sunt.
Omnia experimenta in hoc manuscripto descripta secundum regulas et normas biosalutis Iaponenses peracta sunt.
Composita in dimethylsulfoxido (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) ut solutiones principales dissoluta sunt et in medio MS pro Arabidopsis et tabaco vel medio Gamborg B5 pro hepatica diluta sunt. Ad experimentum inhibitionis incrementi radicum, plus quam decem semina per laminam in medio agariano continenti composita indicata vel DMSO sata sunt. Semina in camera incrementi per septem dies incubata sunt. Plantulae photographatae sunt et longitudo radicum mensurata est. Ad experimentum germinationis Arabidopsis, quadraginta octo semina per laminam in medio agariano continenti 200 μM compositi vel DMSO sata sunt. Semina Arabidopsis in camera incrementi culta sunt et numerus plantularum germinatarum septem diebus post germinationem (dag) numeratus est. Ad experimentum germinationis tabaci, viginti quattuor semina per laminam in medio agariano continenti 200 μM KAND vel DMSO sata sunt. Semina tabaci in camera incrementi culta sunt et numerus plantularum germinatarum post quattuordecim dies numeratus est. Ad experimentum inhibitionis accretionis hepaticae, novem embryones ex unaquaque lamina in medio agariano continenti concentrationes indicatas KAND vel DMSO positi et in camera accretionis per quattuordecim dies incubati sunt.
Ad ordinationem meristemi radicis visualizandam, plantulae tinctae cum 5 mg/ml iodidi propidii (PI) adhibentur. Signa PI microscopio fluorescenti utens microscopio laserico confocali TCS SPE (Leica Microsystems) observata sunt.
Tinctura histochemica radicum cum β-glucuronidasa (GUS) secundum protocollum a Malami et Benfey36 descriptum peracta est. Plantulae per noctem in acetono 90% fixae, tinctae cum 0.5 mg/ml acidi 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronici in liquore GUS per horam unam, et in solutione chloraldehydi hydrata (8 g chloral hydrati, 2 ml aquae et 1 ml glyceri) positae et microscopio differentiali interferentiali utens microscopio Axio Imager M1 (Carl Zeiss) observatae sunt.
Anguli radicum in plantulis septem dierum natis, in laminis verticaliter positis cultis, mensurati sunt. Angulum radicis a directione vectoris gravitatis, ut in gradu sexto descriptum est, metire.
Dispositio microtubulorum corticalium observata est ut descriptum est, cum modificationibus minoribus protocollo 37. Anticorpus anti-β-tubulinum (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) et Alexa Fluor 488-coniugatum anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ut anticorpora primaria et secundaria ad dilutiones 1:1000 et 1:100, respective, adhibita sunt. Imagines fluorescentiae acquisitae sunt microscopio laserico confocali TCS SPE (Leica Microsystems). Acquire imagines Z-stack et crea projectiones maximae intensitatis secundum instructiones fabricatoris.
Examen proliferationis cellularum HeLa peractum est utens Cell Counting Kit 8 (Dojindo) secundum instructiones fabricatoris.
Incrementum E. coli DH5α analysatum est per mensurationem densitatis cellularum in cultura utens spectrophotometro ad 600 nm (OD600).
Ordinatio cytosceleti in cellulis BY-2 transgenicis observata est microscopio fluorescenti instructo instrumento confocali CSU-X1 (Yokogawa) et camera sCMOS (Zyla, Andor Technology). Densitas cytosceleti aestimata est per analysin imaginum, quae percentationem pixellorum cytosceleti inter pixellos cytoplasmaticos in imaginibus confocalibus quantificata est, programmate ImageJ ut descriptum est38,39.
Ad mortem cellularem in cellulis BY-2 detegendam, portio suspensionis cellularis cum 0.05% caeruleo Evans per decem minuta ad temperaturam ambientem incubata est. Tinctio caerulea Evans selectiva cellularum mortuarum ab extrusione tincturae e cellulis viabilibus per membranam plasmaticam integram pendet40. Cellulae tinctae microscopio campi lucidi (BX53, Olympus) observatae sunt.
Cellulae HeLa in DMEM cum 10% FBS supplemento in incubatore humidificato ad 37°C et 5% CO2 creverunt. Cellulae cum 100 μM KAND 11, acido kumamonamico 6, kumamonamido 1, 100 ng/ml colcemidi (Gibco), vel 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) per 6 horas ad 37°C tractatae sunt. Cellulae cum MetOH per 10 min, deinde cum acetato per 5 min ad temperaturam ambiente fixae sunt. Cellulae fixae cum anticorpore primario β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) diluto in 0.5% BSA/PBS per 2 horas incubatae sunt, ter cum TBST lavatae, et deinde cum anticorpore caprino Alexa Fluor incubatae sunt. 488 per 1 horam. – IgG murinum (Thermo Fisher Scientific: A11001) et 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindoli (DAPI) diluti in 0.5% BSA/PBS. Post ablutionem ter cum TBST, cellulae tinctae observatae sunt in microscopio inverso Nikon Eclipse Ti-E. Imagines captae sunt camera CCD Hamamatsu ORCA-R2 refrigerata utens programmate MetaMorph (Molecular Devices).
Tempus publicationis: XVII Iun. MMXXIV